vf.metodos de transferencia de material genetico Flashcards
en bacterias:
-conjugacion
-transduccion
-transformacion
conjugacion
-lederberg y tatum
-el sembrar juntas 2 cepas auxotrofas k12 e.coli se
aislaban en colonias
conjugacion
es el proceso de transferencia horizontal de material genetico entre una celula bacteriana donadora y
una receptora mediante el contacto directo o una conexion que las una
conjugacion
dna extracromosomico
plasmios
proceso mediante el cual el dna es trasnferido de una bacteria a otra mediante un bacterofago (particula fagica transductora, pseudovirion)
transduccion
transduccion
tipos
-generalizada
-especializada
transduccion
transferencia de cualquiere region del genoma bacteriano
generalizada
transduccion
transferencia de loci adyacentes al sitio de integracion del profago
especializada
transduccion
tambien se utiliza para designar el proceso mediante el cual el adn exogeno es
introducido en un celula mediante un vector viral
transduccion
inicialmente un bacteriofago infecta a una bacteria y puede
integrarse en el genoma bacteriano (profago) manteniendo el ciclo lisogenico antes de activar el ciclo litico(vegetativo)
transduccion
el adn puede integrarse al genoma de la bacteria por
recombinacion sitio especifica (homologia de secuencia)
de esta forma permanece en la bacteria de forma establela nueva informacion genetica
variacion hereditaria de una celula bacteriana susceptible, originada por la captacion de adn desnudo libre en el medio, con la posterior integracion del adn exogeno en el genoma celular
transformacion
celula que ha sido transformada
transformante
principio de transformacion por
griffit 1928
transduccion
una bacteria muerta se degrada y libera fragmentos de adn al entorno, otra bacteria puede
captar ese ADN
estado fisiologico caracteristico limitado en el tiempo que permite captar adn del medio exterior, influido por factores ambientales como:
-densidad celular del cultivo
-t°
-ph
-nutrientes
competencia
competencia
es variable en cada especie capaz de
experimentar transformacion
competencia
codificada en el genoma o lograda de
forma artificial
tipos de transformacion
-natural
-artificial
transformacion natural
en algunas especies de bacterias, que cuentan con la maquinaria especifica para llevar
el adn a traves de la membrana
codificada en los genes celulares
tranformacion artificial
no esta codificada en los genes celulares, si no que es
inducida por procedimientos en donde las celulas son convertidas en permeables (competentes) atraves de condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza
transformacion artificial
muchas bacterias (celulas en general) carecen de sistemas
naturales de transformacion
transformacion artificial
se ha conseguido inducir el estado de competencia en celulas que no lo
presentan de forma natural (e.coli)
transformacion artificial
estas tecnicas se basan en tratamientos quimicos y fisicos que producen microporos en la celula, lo que permite la
introduccion de dna exogeno de modo bastante eficiente
transformacion artificial
se puede realizar de forma
-quimica
-microinyeccion
-lipofeccion
-electroporacion
-vectores virales
-biobalistica
quimica
las celulas se incuban en hielo como el dna exogeno en presencia de cationes divalente como Ca+ (CaCl) lo cual
prepara las membranas celulares para ser permeables al DNA exogeno
quimica
enseguida las celulas son incubadas a 42°por 30s (shock termico) lo que causa que el
dna entre en las celulas
electroporacion
aumento de la permeabilidad de la membrana celular mediante
aplicacion de un campo electrico (10-20kV/cm)
electroporacion
se forman poros a traves de los cuales puede entrar el dna
exogeno
electroporacion
una exposicion excesiva a campos electricos puede causar
la muerte celular
vectores virales
se aprovecha la capacidad natural que tienen los virus de ingresar su informacion genetica a
la celula blanco
vectores virales
se selecciona un virus adecuado en base a su estructura y se fabrican
(pseudoviriones) conteniendo la info genetica de interes
vectores virales
pueden obstaculizar la replicacion de
un virus
biobalisitica
pequeñas particulas de oro o tungsteno cubiertas de adn se
disparan a las celulas
biobalisitica
algo del material genetico se quedara en las celulas,
transformandolas
biobalisitica
la eficiencia de trasnformacion es baja, pero la mayoria de las
plantas pueden ser transformadas por este metodo
para que queremos incorporar dna exogeno en una celula?
-clonacion in vivo de ese dna exogeno
-producir y purificar la proteina para la cual codifica dicha secuencia (ej obtencion de insulina humana a partir de e coli)
-estudiar en la celula la expresion de formas alteradas de dicha proteina ej dominios individuales, proteinas de fusion o quimericas, en enfermedades neurodegenerativas, etc
-estudiar la carencia de proteinas especificas
-crear organismos geneticamente modificados
-terapia genica
describe una variedad de procesos que pueden usars para producir copias geneticamente identicas en un ente biologico
clonacion
clonacion
tipos
-dna
-proteina
clonacion
dna
-in vitro/acelular-pcr
-in vivo/celular-amplificacion de moleculas de acido nucleico mediante su introduccion asistida por vectores, en celulas en cultivo
clonacion
proteina
-sistemas de traduccion in vitro
-in vivo-celular
clonacion
proteina
produccion de proteinas mediante la introduccion asisitida de vectores en celulas en cultivo, de la informacion genetica requerida para la sintesis de dicha proteina
in vivo, celular
clasificacion de vectores
-vector de clonacion
-vectorde expresion
vector de clonacion
su finalidad es almacenar secuencias y permitir la obtencion de grandes cantidades del inserto
vector de clonacion
vector de clonacion
-capacidad de expresar el dna recombinante
-su objetivo es producir un transcrito (rna)o la proteina producto de ese transcrito
vector de expresion
vector de clonacion
tiene la caracteristica de poseer:
-secuencias que le permiten mantener su replicacion y la del dna que transportan, independientemente del dna genomico
-secuencias codificantes para un gen de seleccion, el producto del gen no debe de estar presente en el tejido uorganismo. para metodos geneticos o de seleccion fenotipica
-sitios multiples de clonacion
-secuencias que le permiten mantener su replicacion y la del dna que transportan, independientemente del dna genomico
origen de replicacion y secuencias reguladoras en su caso
-secuencias codificantes para un gen de seleccion, el producto del gen no debe de estar presente en el tejido uorganismo. para metodos geneticos o de seleccion fenotipica
-genes de resistencia (ampicilina)
-genes reporteros (lacZ b-galactosidasa, gfp proteina verde fluorescente, luciferasa, etc
-genes que completan defectos nutricionales en cepas mutantes (e.coli trp1, para crecer en medio carente de trp)
-sitios multiples de clonacion
permite la seleccion de sitios de restriccion para la clonacion
vector de expresion
presenta algunas caracteristicas adicionales a las del vectorde clonacion
-secuencias reguladoras
-promotor fuerte/debil inducible/no inducible
-operador
-sitio de union a ribosoma (SUR)
-secuencia de termino de la transcripcion
-secuenciqa de poliadenilacion
-codon de inicio y parode la traduccion
-region potenciadora/promotor de CMV, que permite una fuerte expresion constitutiva en muchos tipos de celulas
-sitio de poliadenilacion de SV40 (viris vacoulado del simio)
-sitio multiple de clonacion
vector pCMVTnT
prodecimiento general
1.preparacion del inserto
2.preparacion del vector
3. preparacion de la construccion o constructo final
4. transformacion
5. seleccion de transformante
6.propagacion de tranformantes
7. purificacion de vectores o proteinas recombinantes
procedimiento
el dna se corta con la o las enzimas de restriccion adecuadas
preparacion del inserto
procedimiento
el policonector o sitio multiple de clonacion MCS permite emplear cualquier combinacion de enzimas de restriccion
preparacion del vector
procedimiento
union covalente in vitro del inserto de DNA al vector cortado empleando una ligasa
-la especificidad depende del tipo de extremos
preparacion de la construccion
procedimiento
-una vez que la celula bacteriana ha sido transformada, esta crece en medios de cultivo selectivos solidos
-metodos geneticos o de seleccion fenotipica
-levantamientos de colonias o placas
seleccion de transformantes
procedimiento
se seleccionan las colonias de interes y se crecen en medio liquidos
propagacion de transformantes
