vc. pcr y sus variantes Flashcards
pcr,puede amplificar selectivamente una secuencia deseasa de adn de copia unica que se encuentra presente en una mezcla compleja de
moleculas de adn sin purificacion previa de la secuencia de interes
sintesis de adn durante la pcr
los primers o cebadores (oligonucleotidos) logran que solo se amplifique una zona del adn en
la pcr
sintesis de adn durante la pcr
la adn polimerasa termoestable sintetiza la hebra complementaria incorporando los deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) libres (A T G C) del medio de reacción, inicialmente dirigida por
los primers o cebadores
sintesis de adn durante la pcr
ciclos controlados de temperaturas de desaturalizacion,
alineamiento y elongacion
mezcla de reaccion
dna
primers o cebadores (oligonucleotidos)
taq polimerasa
dNTPs (A T G C)
aumentos de t° para romper
los puentes de hidrogeno
la t° de desnaturalizacion usualmente es de
94 a 95°c
t° mayor o igual a 90°c evitan la
renaturalizacion del dna
oligonucleotidos especificos (20-23nt) cuya secuencia es complementaria a los extremos del fragmento (zona del DNA) que se desea amplificar
primers o cebadores
al disminuir la t° los primers hibridan especificamente en los extremos de la secuencia
blanco
*un primer en cada hebra
los primers dirigen a la adn polimerasa que sintetiza la hebra complementaria incorporando
los nucleotidos libres ( A T G C) del medio de reacción
al final del 1er ciclo se obtienen
2 moleculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco
solo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado ya que la polimerasa solo puede
copiar moleculas que tienen el cebador unido
al final de 2do ciclo se han obtenido 4 moleculas de adn doble cadena parcial que contienen
la secuecia blanco
al final del 3er ciclo se han sintetizado 8 moleculas de ADN doble cadena que contienen la
secuencia blanco
al final del 4to ciclo se han sintetizado
16 moleculas de ADN doble cadena que contienen la secuencia blanco
al final de 5to ciclo se tienen
32 moleculas de ADN doble cadena que contienen la secuencia blanco
despues de 30 ciclos hay mas de
1x10*9 moleculas del producto especifico y solamente 60 moleculas parcialmente doble cadena mas largas
tiene la capacidad de mantener cambios de temperatura ciclicos de forma precisa
maquina de pcr
pcr punto final o convencional
podemos considerar que un mayor numero de copias de dna molde da una banda mas
intensa del amplificado (hasta cierto punto ya que cantidades excesivas de dna molde inhiben la reaccion)
a mayor numero de ciclos
mayor cantidad del producto de pcr (amplificado)
variantes de la pcr
-con adaptadores
-inversa
-mutagenesis dirigida
-rt-pcr
-tiempo real
-rt.qpcr
-multiplex
pcr, con adaptadores
amplificar una region de and de secuencia
desconocida
pcr, con adaptadores
se unen adaptadores a los fragmentos de restricción de
extremos cohesivos
pcr, con adaptadores
se añaden primers específicos para las secuencias
de los adaptadores
pcr, inversa
permite amplificar secuencias desconocidas con la condición de que
se encuentran al lado de una secuencia desconocida
se refiere a una amplia variedad de técnicas in vitro que modifican la secuencia silvestre
mutagenes dirigida
mutagenes dirigida
p, ej. cuando no hay sitios de restricción localizados en
el lugar deseado, se puede emplear un enfoque de pcr
mutagenes dirigida
se pueden cambiar de 1 a 3 bases en un segmento de dna determinado
sintetizando primers de pcr que lleven a estos cambios
rt-pcr
se emplean
2 enzimas polimerasas
rt-pcr
la dna polimerasa rna dependediente (retrotranscriptasa) realiza la
síntesis de cDNA a partir de mRNA
rt-pcr
los clones de cDNA contienen secuencias codificantes que son
discontinuas (mayoría de genes eucariotas)
rt-pcr
después el cDNA se amplifica por
PCR (dna pol dna dependiente)
pcr tiempo real
fluorescencia
-syber green
-sondas taqman
no es un agente intercalante sino que se asocia a la molecula de and interactuando con la hendidura MENOR
sybergreen
el complejo resultante adn-syber green presenta el pico de absorción en 495nm y el de emisión en
522nm (zona verde del espectro, de ahí su nombre)
qpcr
también conocida como pcr
cuantitativa
qpcr
amplifica y simultaneamente cuantifica de forma absoluta el producto especifico de la
amplificación
qpcr
a la mezcla de reacción se adiciona un fluoroforo que emite fluorescencia en función de
la abundancia del producto de amplificación
qpcr
la medición de la fluorescencia se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es
por esto que se le denomina pcr en tiempo real
numero de ciclos requeridos para que la fluorescencia especifica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecifica
ct
ct
inversamente proporcional a la cantidad de adn
blanco inicial
sondas taq man
el principio de la sonda taq man se basa en la
actividad 5’-3’ exonucleasa de la polimerasa
sondas taq man
se aumenta significativamente la especificidad
de la detección
sondas taq man
al igual que en los otros métodos de qPCR, la fluorescencia resultante de la acumulación del producto se mide durante
la fase exponencial de la pcr
Rt-qPCR
la primera reacción de retrotranscripcion se lleva a cabo de la misma manera por la dna pol rna dependiente obteniendose el
cDNA a partir del mRNA
Rt-qPCR
después de cDNA se amplifica por PCR
cuantitativa
Rt-qPCR
los niveles de expresión de un gen en particular se normalizan con respecto al nivel de expresión de un gen
constitutivo para poder hacer la comparación entre muestras, tratamientos y/o condiciones de la célula
pcr multiplex
se amplifica mas de una secuencia en una
misma reacción
pcr multiplex
emplea 2 o + pares de primers en un unico tubo de reacción con el fin de
amplificar simultaneamente multiples segmentos de adna
