Inmunotecnicas Flashcards
antigeno
-molecula que induce la formación de al menos un anticuerpo especifico
-tiene uno (al menos) o mas epitopes
epitope
-region de la molecula del antigeno que es reconocidda por el anticuerpo, formada por aa (secuencial/lineal o conformacional/discontinuo)
anticuerpo
-proteina serica conocida como ig que reconoce especificamente a un epitope del antigeno
-la region constante (fc) es especifica de especie
anticuerpo monoclonal
-anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos b
anticuerpos policlonales
-mezcla heterogenea de anticuerpos producidos por diferentes clones de celulas B
(purificacion de sueros de animales inmunizados)
EMSA
electrophoresis mobility shift assay
-puede considerarse una inmunotecnica al emplearse un anticuerpo especifico contra la proteina de union al acido nucleico (super retraso en gel)
inmunohistoquimica
-herramienta para identificar y localizar antigenos (proteinas) en una muestra de tejido; (histologia-citoarquitectura, inmunohistoquimica-distribucion)
inmunohistoquimica
metodo directo
-anticuerpo primario especifico para el antigeno que estamos tratando de identificar, acomplado a una enzima
inmunohistoquimica
metodo indirecto
-anticuerpo primario de una especie (raton o conejo) en contra del antigeno que estamos tratando de identificar
-anticuerpo secundario, contra la fc la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario, acoplado a una enzima
metodología
-fijacion: inmoviliza las celulas y las preserva, une covalentemente las moleculas proteinas a sus vecinas (p-formaldehido, glutaraldehido, citrato ph, edta p.h 9.0)
-cortes: cortes finos por un microscopio
-en cualquier caso, un sistema de deteccion o visualizacion, cromogeno para la enzima
-montaje
higado, virus de la hepatitis B
-HBcAg y HBsAg
-indica replicacion activa del virus
microscopia de fluorescencia
-detectar especificamente algunas proteinas u otras moleculas en celulas y tejidos
-fluorocromo
flurocromo
-molecula fluorescente
-una parte de ella (flouroforo) absorbe la luz de una determinada longitud de onda y emite luz de otra longitud de onda mas larga
inmunohistoquimica
metodo directo
anticuerpo primario especifico para el antigeno (Ag) que estamos tratando de identificar, acoplado a un flurocromo (f)
inmunohistoquimica
-anticuerpo primario de una especie (ej. raton o conejo) en contra del antigeno (ag) que se esta estudiando
-anticuerpo secundario acoplado a un fluorocromo (f)
-el anticuerpo secundario reconoce especificamente la region constante (Fc) de la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario
colocalizacion
-superposicion espacial entre dos etiquetas fluorescentes diferentes
contratincion
-empleo de diferentes moleculas al mismo tiempo en una preparacion
-ej. empleo de diferentes pares de anticuerpos primario/secundario. La tincion de nucleos se logra con DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol) o ioduro de propidio
microscopia confocal de fluorescencia
-permite obtener una imagen de la arquitectura tridimensional de una celula o un tejido
-utiliza metodos electrnicos que permite enfocar un plano de una muestra eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores e inferiores a ese plano
-a partir de una serie de secciones opticas obtenidas a diferentes profundidades, archivadas en un ordenador, resulta sencillo construir una imagen tridimensional
-de otra forma, el proceso de obtencion de secciones finas, se pierde informacion respecto a la tercera dimension
microscopio de fluorescencia
- filtro: deja pasar solamente la luz de cierta longitud de onda
- filtro: deja pasar la señal fluorescente de cierta longitud de onda especifica
- espejo dicroico: refleja la luz de cierta longitud de onda y transmite la luz a una long de onda mayor
ej. nucleo de un fibroblasto
-el BrdU, agregado como un breve pulso, identifica las regiones en proceso sintesis activa de DNA
-DNA polimerasa y PCNA colocalizan en regiones de sintesis activa de DNA
parametros medibles por citometria de flujo
-marcaje con fluorescencia
-se puede detectar cualquier molecula en la celula, en tanto que tengamos un anticuerpo especifica para ella, acoplado a un flurocromo
-las celulas pueden contarse
-las celulas pueden incluso ser separadas y recuperadas (cell sorting)
citometria de flujo
-se emplea en el recuento y clasificacion de celulas segun sus caracteristicas
+morfologicas:
-tamaño
-granularidad
+presencia de biomacadores
-marcados especificamente meduante anticuerpos acoplados a flurocromos
poblaciones leucocitarias
nota. la baja cantida de eosinofilos y basofilos hace que en general no se definan en base a FSC y SSC
pureza y viabilidad de poblaciones celulares
-ej. linfocitos T cooperadores (CD4+) y citotoxicos (CD8+)
-un compuesto como el ioduro de propidio atraviesa la membrana celular alterada en celulas muertas y las tiñe
-las celulas muertas no presentan fluorescencia en ese canal
elisa
ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima
permite evaluar a una proteina de manera cuantitativa
+directo
+indirecto
+tipo sandwich
elisa
directo:
ej. deteccion de Ag en sangre u orina
elisa
indirecto
ej. deteccion de Ag con un solo secundario acoplado a enzima-cambiando el primario o deteccion de anticuerpo (HIV-SARS-COV-2)
elisa
tipo sandwich
ej. deteccion de Ag, mas sensible, el Ag se retiene en la placa mediante su union especifica al anticuerpo de captura y el segundo a-Ag es policlonal; se amplifica la señal VS directo e indirecto
western blot
clasificacion
- electroforesis
2.transferencia
-electrotransferencia
-difusion simple o pasiva - inmunodeteccion
western blot
-permite la deteccion mediante un anticuerpo especifico de una proteina dentro de una muestra biologica
+estimar el tamaño de la proteina (corrimiento electroforetico)
+evidenciar isoformas (variantes alelilas que generan distintas fromas de la misma proteina, splicing alternativo, o maduracion diferencial)
+podrian ser reconocidad por el mismo anticuerppo pero variaran en peso molecular
+comparar los niveles (cantidad) de proteina entre muestras
proteina de difusion con una etiqueta de epitopo
-comunmente la proteina blanco esta inalterada y se asume que conserva su fx y localizacion normal
-la etiqueta es una secuencia proteica corta que es reconocida fuertemente por un anticuerpo comercial bien caracterizado
-se puede emplear:
+inmunofluorescencia: el anticuerpo esta unido al fluorocromo
+inmunoprecipitado: permite identificar interacciones funcionales proteina-proteina con proteinas hasta ese momento desconocidas
inmunoprecipitado:
-el complejo proteico puede estar formado por varias proteinas, las cuales seran en seguida estudiadas
-una variante puede ser la purificacion del complejo proteico por columna de afinidad, inmovilizando el anticuerpo en la columna
