Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
extracción al:
-DNA
-RNA
cuantificación y determinación de la pureza por medio de:
espectrofotometro
purificación por medio de:
-cromatografia de afinidad
-electroforesis:
*convencional en gel (analisis cualitativo y cuantitativo)
*campo pulsado
*capilar
- muestra de células
por ejemplo:
-piel
-cabello
-de la mucosa bucal
-sangre (CMSP)
*gradiente de fincoll
celulas polimorfonucleares
-granulocitos
*neutrofilos 62
*eosinofilos 2.3
*basofilos 0.4
celulas mononucleares
-agranulocitos
*monocitos 5.3
*linfocitos 30
- buffer de lisis
contiene:
-50mM Tris-HCl ph 8
-1% SDS (dodecil sulfato de sodio)
-proteasa, proteinasa K (2mg/ml)
buffer para mantener el ph en el cual el dna se mantiene estable y con carga negativa
50mM Tris-HCl ph 8
-detergente anionico para romper las membranas promoviendo la liberación de dna
-desnaturaliza las proteinas (inactivando p, ej. DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa
1% SDS (dodecil sulfato de sodio)
cuando el SDS entra en contacto con la célula…
captura los lipidos y las proteinas, el acido nucleico permanece en solución
-aislada del hongo tritirachium album
-serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes
-altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizantes
-capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas
-destruir proteinas que crean un enlace con el dna (ej, histonas, factores de transcripción, polimerasas)
proteinasa k
incrementa:
-la pureza del DNA, menor contaminación por proteinas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado
proteinasa K
- precipitación de proteinas:
-p, ej. con soluciones de acetona
-las proteinas se insolubilizan y precipitan
-se puede separar por centrifugación, quedando en el prepicipitado (pellet), junto con los restos celulares
-en el sobrenadante se encuentra el acio nucleico
- precipitación de dna
-alta concentración de sales NaCl
-los iones na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
-las moleculas de dna se juntan en lugar de repelerse una a la otra
-se disminuye la solubilidad del dna en el ambiente acuoso
-de esta manera se facilita la precipitación del dna al añadir el alcohol
-es una molecula menos polar que el agua
-es misicible con el agua
alcohol frio (etanol)
la polaridad del RNA es __________ que la del DNA por lo que no precipita
mayor
el dna no es soluble en ….
ETANOL por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el dna precipita
al disminuir la t° el DNA
se insolubiza aun mas (incubacion en hielo)
- lavados
-se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el dna
- resuspención del dna
-se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej. 25-100ul)
- concentración y pureza
-los espectros de absorbancia de acidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestran niveles maximos a 260-280nm, respectivamente
-el espectrofotometro calcula la concentración de acidos nucleicos en la solución en base a la absorbancia a 260nm
-la pureza se determina mediante el coeficiente 260/280
1.8-2
optima
1.6-1.8
aceptable
-1.6
contaminación con compuestos aromaticos y proteinas
+2.1
contaminación con rna
extracción de RNA
-metodo del fenol-cloroformo (inicialmente en fase continua)
metodo del fenol-cloroformo
paso 1
rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los acidos nucleicos de moleculas asociadas
metodo del fenol-cloroformo
paso 2
la adición de mas cloroformo separa las fases
-polaridad fenol + cloroformo
-el dna menos polar que el rna se queda entre las fases acuosa y fenolica junto con las proteinas
-el rna permanece disuelto en la fase acuosa
metodo del fenol-cloroformo
paso 3
se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frio
el isopropanol es un alcohol menor polar que
el etanol
metodo del fenol-cloroformo
4,5,6,7
- centrifugar
- lavar el pellet EtOH 75%
- resuspender el rna
- coeficiente 260/280
rna
2.0-2.2
optima
rna
+1.7
aceptable
rna
-1.7
contaminación con compuestos aromaticos y proteinas
el fenol es _____ polar que el cloroformo
mas
cromatografia de afinidad para separar acidos nucleicos, p, ej
mRNA
factores instrinsecos a la particula
-relacion carga/masa
-peso molecular
factores extrinsecos a la particula
-concentracion de agarosa
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-t°
agarosa es
-un polisacarido formado por B-1-4-3-6-anhidro-L-galactosa y a-1-3-D-galactosa
-soluble en agua a t° superiores a 65°
-forma una matriz inerte y no toxica
concentracion de agarosa
-tipicamente de 0.5 a 4% (peso/volumen)
la movilidad disminuye al _________ el porcentaje de agarosa
aumentar
voltaje aplicado tipico
-10V/cm de gel
voltaje aplicado en geles de 10-15cm
100v-130v
al incrementar el voltaje la movilidad _________, aunque no necesariamente incrementa la resolucion
aumenta
mejor resolución (5v/cm de gel)
voltajes menores (ej 70mv)
a menor voltaje…
mayor difusión lateral
a mayor tiempo de corrida….
mayor resolución
temperatura:
-al incrementar la t°, la movilidad incrementa como si hubiera disminuido la concentración de agarosa
-precaución: si la t° se incrementa mucho se puede fundir el gel
-normalmente la t° se mantiene lo mas baja posible
a mayor voltaje y mayor tiempo de corrida…
mayor temperatura y la movilidad
revelado y visualización de acidos nucleicos con:
-bromuro de etidio
-SYBR
bromuro de etidio
-se intercala entre las bases
-absorbe a 260-360 (uv) y emite fluorescencia rojo naranja (560nm)
-detecta hasta un ng de dsDNA
-en la agarosa o post corrida
SYBR
-no intercalante
-alternativa menos toxica aunque menos sensible (-3ng)
-mezcla de moleculas (acido nucleico) de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinacion del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas
+sinteticos (ej 100pb, 1kb)
+dna de fagos o plasmidos digeridos por enzimas de restricción (endonucleasas especificas de secuencia)
marcadores de peso molecular
analisis cualitativo
no se puede conocer…
el numero exacto de pb de las bandas en el corrimiento de las muestras, por eso se habla de peso molecular aparente
analisis de retraso en gel
-EMSA
Electroforesis mobility shoft assay
-basada en la interaccion entre acidos nucleicos y proteinas
-los complejos acidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del acido nucleico correspondiente disminuye (se retrasa su avance en el gel)
-permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleuco (ej tfbs) y alguna proteina funcional particular (ej factor de transcripción)
mayor resolucion empleando un voltaje ____________ desde luego mayor tiempo de corrida y posiblemente un % mayor de agarosa
menor
-separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases)
-reorientación de la molecula mediante cambios periodicos en la orientacion de campo electrico E1 y E2
electroforesis en gel de campo pulsado
al aplicar E1 las cadenas de…
DNA se estiran y orientan en esa dirección
al aplicar E2 mas o menos perpendiculares a…
E1, se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección
a las cadenas mas cortas les toma _______ tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
menos
aplicacion sucesiva de campos electricos
E1/E2/E1/E2…
el angulo alfa de reorientacion (entre E1 y E2) es mayor a:
100°
para evitar que el dna se fragmente al cargar la muestra se utilizan:
disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso celulas completas que lo contienen
usualmente el dna genomico se digiere con…
enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforetico
geometria de los intrumentos para PFGE
-campos electricos no homogeneos
-campos electricos homogeneos
campos electricos no homogeneos
-alfa va incrementandose
-pfge
-ofage
-rafe
campos electricos homogeneos
-alfa permanece constante
-fige
-chef
-rge
flechas largas
dirección neta de migración
flechas cortas
vectores de fuerza de los campos electricos alternantes
cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de dna a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y ___________ el voltaje
menor
-capilares de silice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas
-campo electrico alto (100-500V/cm)
-permitir obtener resultados en corto tiempo (5-60min)
-minimo consumo de muestra (nL)
-muy alta resolución, 1 nucleotido de diferencia
-muy empleada en la secuencia automatizada
electroforesis capilar
el dna de un gen discontinuo __________ ____(mayor peso molecular)
posee intrones
el cDNA se corresponde al mRNA, el cual ______ _____ (menor peso molecular)
carece de intrones
lisis celular por sonicación:
l-a corriente electrica transmite su energia a un sistema mecanico que la convierte en vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido y vibración
-en ell liquido se generan millones de burbujas microscopicas, las cuales sufren rapidisimos procesos de expanción y colapso
DNA genomico puede :
-lisis celular por sonicación
-degradación por acción de DNAasas durante la extracción
