vd. secuenciación de dna Flashcards
fue posible en los años 1940, gracias a:
-introduccion de métodos electroforeticos
-conocimiento de la química de los nucleotidos
-metabolismo del dna
el principio general era
obtener 4 juegos fragmentados marcados, cada uno correspondiente a cada una de las 4 bases
en un principio se empleo
marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia
metodos
-quimico
-enzimatico
-siguiente generación
-secuenciacion por bisulfito
metodo quimico
maxam y gilbert (radiactividad)
metodo enzimatico
-Sanger (radiactividad)
-automatizada (variación del Sanger-fluorescencia)
siguiente generación (next-gen sequencing)
-424 pirosecuenciacion
-illumina (terminador reversible)
metodo de maxam y gilbert consta de 3 etapas fundamentales:
-marcaje de dna
-hidrolisis química especifica del dna
-analisis de los productos
m. de maxman y gilbert
-consiste en marcar el extremo 5’ de cada hebra
-lo mas común es usar polinucleotido cinasa y atp radiactivo
marcaje del adn
m. de maxman y gilbert
-para obtener fragmentos de adn de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleotido conocido
hidrolisis química especifica del adn
m. de maxman y gilbert
-la muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de eliminar separadamente las bases puricas (G y A) y pirimidinicas (C y T)
hidrolisis química especifica de adn
m. de maxman y gilbert
los agentes químicos utilizados para cada caso son:
-dimetil sulfato G
-acido formico-dimetilsulfato-piperidina A G
-hidrazina-piperidina C T
-hidrazina-1.5M NaCl-piperidina C
hidrolisis química especifica
m. de maxman y gilbert
las 4 mezclas obtenidas se analizan por electroforesis
análisis de los productos
metodo Sanger
se basa en el mecanismo normal de la
replicaron del dna
metodo Sanger
la dna polimerasa extiende la cadena de dna debiendo estar presente el grupo hidroxilo en el
carbono 3’ de la desoxirribosa (la polimerizacion ocurre solo en la dirección 3´)
metodo Sanger
se emplean 2’,3’- dideoxinucleotidos trifosfato (ddNTPs) además de los normales 2’-deoxinucleotido trifosfato (dNTPs)
metodo de Sanger
metodo Sanger
los ddNTPs carecen del grupo hidroxilo necesario para que
se lleve a cabo la polimerizacion
metodo Sanger
fragmentos de diferentes longitudes se generan por
interrupción de la polimerizacion cada vez que un ddNTP se incorpora a la cadena creciente
metodo Sanger
la polimerasa empleada deberá de carecer de la actividad 3’-5’ exonucleasa de
corrección
el resultado de cada una de las 4 reacciones (cada una es una mezcla de fragmentos terminados en el mismo nucleotido) se separa por
electroforesis en gel y se detecta la radiactividad de diferentes longitudes
en un gel de poliacrilamida (entre 6 y 8%) se pueden observar las diferencias de longitud de
un solo nucleotido
con urca 6-8M °C (condiciones desnaturalizares) se impide que los fragmentos formen puentes de hidrogeno entre
sí
el revelado autoradiografia muestra solo las
hebras nuevas (la hebra molde, de tamaño muy superior, se localizara en la parte superior del gel, pero no se detecta por no estar marcada
análisis del patron de hebras
cada banda corresponde a un fragmento, marcado, cuyo nucleotido 3’-terminal es el didesoxi usado en
esa muestra (calle o carril del gel)
análisis del patron de hebras
la posición de la banda corresponde a la longitud del
fragmento (calibración del gel)
análisis del patron de hebras
puesto que todos tienen un extremo 5’ común (el cebador), la longitud coincide con
la posición del nucleotido terminador (ddNTP)
