vd. secuenciación de dna Flashcards
fue posible en los años 1940, gracias a:
-introduccion de métodos electroforeticos
-conocimiento de la química de los nucleotidos
-metabolismo del dna
el principio general era
obtener 4 juegos fragmentados marcados, cada uno correspondiente a cada una de las 4 bases
en un principio se empleo
marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia
metodos
-quimico
-enzimatico
-siguiente generación
-secuenciacion por bisulfito
metodo quimico
maxam y gilbert (radiactividad)
metodo enzimatico
-Sanger (radiactividad)
-automatizada (variación del Sanger-fluorescencia)
siguiente generación (next-gen sequencing)
-424 pirosecuenciacion
-illumina (terminador reversible)
metodo de maxam y gilbert consta de 3 etapas fundamentales:
-marcaje de dna
-hidrolisis química especifica del dna
-analisis de los productos
m. de maxman y gilbert
-consiste en marcar el extremo 5’ de cada hebra
-lo mas común es usar polinucleotido cinasa y atp radiactivo
marcaje del adn
m. de maxman y gilbert
-para obtener fragmentos de adn de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleotido conocido
hidrolisis química especifica del adn
m. de maxman y gilbert
-la muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de eliminar separadamente las bases puricas (G y A) y pirimidinicas (C y T)
hidrolisis química especifica de adn
m. de maxman y gilbert
los agentes químicos utilizados para cada caso son:
-dimetil sulfato G
-acido formico-dimetilsulfato-piperidina A G
-hidrazina-piperidina C T
-hidrazina-1.5M NaCl-piperidina C
hidrolisis química especifica
m. de maxman y gilbert
las 4 mezclas obtenidas se analizan por electroforesis
análisis de los productos
metodo Sanger
se basa en el mecanismo normal de la
replicaron del dna
metodo Sanger
la dna polimerasa extiende la cadena de dna debiendo estar presente el grupo hidroxilo en el
carbono 3’ de la desoxirribosa (la polimerizacion ocurre solo en la dirección 3´)
metodo Sanger
se emplean 2’,3’- dideoxinucleotidos trifosfato (ddNTPs) además de los normales 2’-deoxinucleotido trifosfato (dNTPs)
metodo de Sanger
metodo Sanger
los ddNTPs carecen del grupo hidroxilo necesario para que
se lleve a cabo la polimerizacion
metodo Sanger
fragmentos de diferentes longitudes se generan por
interrupción de la polimerizacion cada vez que un ddNTP se incorpora a la cadena creciente
metodo Sanger
la polimerasa empleada deberá de carecer de la actividad 3’-5’ exonucleasa de
corrección
el resultado de cada una de las 4 reacciones (cada una es una mezcla de fragmentos terminados en el mismo nucleotido) se separa por
electroforesis en gel y se detecta la radiactividad de diferentes longitudes
en un gel de poliacrilamida (entre 6 y 8%) se pueden observar las diferencias de longitud de
un solo nucleotido
con urca 6-8M °C (condiciones desnaturalizares) se impide que los fragmentos formen puentes de hidrogeno entre
sí
el revelado autoradiografia muestra solo las
hebras nuevas (la hebra molde, de tamaño muy superior, se localizara en la parte superior del gel, pero no se detecta por no estar marcada
análisis del patron de hebras
cada banda corresponde a un fragmento, marcado, cuyo nucleotido 3’-terminal es el didesoxi usado en
esa muestra (calle o carril del gel)
análisis del patron de hebras
la posición de la banda corresponde a la longitud del
fragmento (calibración del gel)
análisis del patron de hebras
puesto que todos tienen un extremo 5’ común (el cebador), la longitud coincide con
la posición del nucleotido terminador (ddNTP)
los fragmentos ordenados de menor a mayor (de abajo a arriba) corresponden a la secuencia de la
hebra nueva leída de 5’ a 3’, la secuencia del DNA partida será la complementaria
secuenciación automatizada
los ddNTPs están marcados con fluorescencia en lugar de
radiactividad (un colo diferente c/u)
secuenciación automatizada
la reacción se lleva a cabo en un solo
tubo
secuenciación automatizada
la separación de los fragmentos de dna se logra por
electroforesis capilar detectando diferencias en longitud de un solo nucleotido
secuenciación automatizada
los fragmentos mas cortos estarán igualmente hacia 5’ y los mas largos se encontraran en dirección
3’
fluoroforos empleados
A-JOE
C-FAM
G-TAMRA
T-ROX
fluoroforos derivado de la fluorescencia
A-JOE
C-FAM
fluoroforos derivado de rodamina
G-TAMRA
T-ROX
cada ddNTP esta marcado con un fluorocromo único que florece a una longitud de onda distinta (color), la reacción se hace en un solo tubo, ya que se
puede distinguir entre ellos
grafico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis
electroferograma
para la detección de un polimorfismo o mutación puntual, se puede comparar la secuencia de una región especifica en una persona portadora del polimorfismo/mutacion que incluso
puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutacion asociado a la enfermedad
secuenciación de DNA
una reacción de secuenciación emplea un solo primer, lo que permite
obtener la secuenciación de una de las cadenas
secuenciación de DNA
en un análisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando
el otro primer especifico
454- pirosecuenciacion
permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en
unas hora
454- pirosecuenciacion
metodo de secuenciacion de adn en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (ppi) que tienen lugar en
la reacción de polimerizacion del adn a partir de sus dNTPs
454- pirosecuenciacion
no se requiere correr los fragmentos en un gel, ni
marcadores fluorescentes o ddNTPs
454- pirosecuenciacion
el genoma se fragmenta en cadenas de algunos cientos de
pares de bases (300-800pb)
454- pirosecuenciacion
se ligan oligonucleotidos sintéticos A y B a los
extremos
454- pirosecuenciacion
para que la secuencia se una a una microesfera (micro reactor)
oligonucleotido a
454- pirosecuenciacion
para la amplificación (pcr en emulsion) y secuenciación
permiten la hibridación de un primer/cebador universal
oligonucleotido b
pcr en emulsion
cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de
aceite y seara de las demás esferas
pcr en emulsion
al final aproximadamente 2 millones de fragmentos de DNA idénticos en cada
micro esfera
preparación de la micromatriz
las micro esferas se deposita en una microcelda con 200,000 pocillos de
44 um
preparación de la micromatriz
una sola esfera por
pozo
preparación de la micromatriz
los pocillos se rellenan con esferas mas pequeñas en las que se han
inmovilizado enzimas de secuenciación
enzimas necesarias para la pirosecuanciacion
-dna polimerasa
-sulfirasa y sus sustrato
-luciferina y sus sustrato
-apirasa
incorpora dNTPs liberando PPi
dna polimerasa
sulfirasa y sus sustrato (adenosina 5’-fosfosulfato o APS), hace:
síntesis de atp dependiente de ppi
emisión de luz dependiente de ATP
luciferasa y su sustrato (luciferina)
degradación de dNTPs no incorporados
aspirasa
pirosecuenciacion
el sistema de flujo hace pasar de manera secuencial cada uno de los 4 nucleotidos (TACG) a través de la
placa que contiene los pocillos
pirosecuenciacion
cada vez que en uno de los pocillos se incorpora un nucleotido se genera una señal quimioluminiscente que es
recogida por una cámara digital
pirosecuenciacion
se analizan las imágenes obtenidas y se determina
la secuencia del fragmento
pirosecuenciacion
se reconstruye la secuencia del genoma original por
metodos computacionales
pirosecuenciacion
si el pozo no flourece es porque
no corresponde la base
illumina. terminador reversible
nucleotidos terminados marcados bloqueados reversiblemente en el
3’oh
illumina. terminador reversible
el bloqueo se retira química y fotoliticamente después de haberse incorporado un nucleotido a la cadena (polimerizacion) y registrado la
señal fluorescente que permite identificar que base fue
secuenciación por bisulfito
permite detectar con alta sensibilidad patrones de
metilacion aberrantes (cambios epigeneticos-dna)
secuenciación por bisulfito
el tratamiento con bisulfito (previo a la secuenciación) convierte a la citosina en
uracilo pero no afecta a la 5-metilcitosina
secuenciación por bisulfito
falsos positivos:
en el RNA y muestras con conversión incompleta
secuenciación por bisulfito
util en análisis de muestras forenses, células madres y
enfermedades como el cancer
