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Biología Molecular > Purificación de proteínas > Flashcards

Purificación de proteínas Flashcards

1
Q

con cada paso de purificacion la cantidad de muestra…

A

se hace mas pequeña (la actividad especifica va siendo mayor)

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2
Q

purificacion de proteinas:

A

-cromatografia:
+en papel
+en capa fina
+en columna
+de intercambio ionico
+de exclusion molecular
+de afinidad
+cromatografia liquida de alto rendimiento

-electroforesis en gel de poliacrilamida
+1 dimension PAGE
+2 dimensiones 2D

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3
Q

cromatografía

A

-tecnica para fraccionar mezclas organidas (P,C,L y aplicaciones concretas en acidos nucleicos) al desplazarse a traves de la matriz
-metodo de separacion en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de particion entre una fase movil y una fase estacionaria para separar los componentes de una mezcla

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4
Q

coeficiente de partición

A

-cociente entre las concentraciones de una sustancia en las 2 fases formadas por 2 disolventes inmisibles en equilibrio
-mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos 2 disolventes

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5
Q

un soporte (matriz) mantienen sostenida la fase estacionaria…

A

y la fase movil acarrera la muestra

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6
Q

los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria…

A

tendran un tiempo de retencion (desde la entrada hasta el detector/salida) mayor

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7
Q

influencia de efectos contrapuestos

A

-retencion
-desplazamiento

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8
Q

influencia de efectos contrapuestos
retención

A

efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un solido o un liquido anclada a un soporte solido

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9
Q

influencia de efectos contrapuestos
desplazamiento

A

efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil (eluyente), que puede ser un liquido o un gas

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10
Q

elución/eluir

A

migración/migrar de los componentes de una mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil

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11
Q

tipos de comatografía

A

dependiendo de la naturaleza de las fases estacionaria y movil

+s-l
+l-l
+l-g
+s-g

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12
Q

solido-liquido

A

fase estacionaria es un solido y la movil es una liquido

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13
Q

liquido-liquido

A

fase estacionaria es un liquido anclado a un soporte solido y la movil es un liquido

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14
Q

liquido-gas

A

fase estacionaria es un liquido no volatil impregnado en un solido y la fase movil es un gas (p. ej. helio, para lipidos)

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15
Q

solido-gas

A

fase estacionaria es un solido y la movil es un gas

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16
Q

cromatografia en papel

A

-fase estacionaria: papel filtro
-version primitiva de la capa fina
-para aa individuales o dipéptido
-empleada por sanger (1945) en la secuenciación de la insulina

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17
Q

cromatografia en capa fina

A

-fase estacionaria: placa adsorbente, los mas usados sílica gel (SiO2) y alumina (Al2O3), adherido a un soprte de plástico, vidrio o aluminio

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18
Q

cromatografia en columna

A

-fase estacionaria (ej. silica gel o alumina) se empaqueta en una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases

-la muestra se aplica en la parte sup de la columna y se aluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades

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19
Q

cromatografia en columna
ej

A

-un eluyente polar desplzara las moleculas mas polares rapidamente a traves de la columna
-si el eluyente es muy polar la elucion sera muy rapida y generalmente habra poca separación

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20
Q

cromatografia en columna
2

A

-componentes que eluyen a diferentes velocidades podran ser separados
-se colectan fracciones de determinados volumenes y se produce a identificar la fracción enriquecida con el/ los eluato (s) de interés
-los componentes puede ser colectados para su analisis post

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21
Q

cromatografia de intercambio iónica

A

-aprovecha las diferentes en signo y magnitud de las cargas que tienen las moleculas como las proteinas a distinto ph
-el mecanismo basico es el intercambio reversible de los iones de solución con los grupos funcionales cargadas( con carga) unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
+intercambio cationico
+intercambio anionico

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22
Q

intercambio cationico (resina carga negativa)

A

-fuerte: acido sulfonico
-debil: acido carboxilico

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23
Q

intercambio anionico (resina carga positiva)

A

-fuerte: aminas cuaternarias
-debil: aminas secundarias o terciarias

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24
Q

intercambio ionico de peptidos

A

-separacion se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentracion de sales de la fase movil para crear un gradiente
-moleculas con carga opuesta a la matriz migraran mas lentamente que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria

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25
Q

cromatografia de exclusion molecular
o filtración en gel

A

-fase estacionaria: material poroso interno
-separacion del soluto segun su tamaño y estructura molecular
+las moleculas pequeñas entran en el laberinto de los espacios dentro de la matriz y son retrasadas
+las moleculas grandes no entran dentro de las cavidades de la matriz y atraviesan mas libremente recuperandose en las primeras fracciones

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26
Q

cromatografia de afinidad

A

-de mayor especificas y selectividad para la purificacion de biomoleculas

-se basa en la interacción especifica de 2 moleculas:
+antigeno/anticuerpo
+enzima/sustrato
+receptor/ligando
-una de ellas se une a la fase estacionaria

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27
Q

cromatografia de afinidad
2

A

-las moleculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria se liberan mediante un cambio del medio eluyende a condiciones en las que la interaccion se debilite:
+ph (lo que afecta el estado de ioniacion de las biomoleculas)
+fuerza ionica (concentración de sales, afecta las interacciones ionicas)
+polaridad (solubilidad)
+solucion de las moleculas inmovilizadas

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28
Q

HPLC
high performance liquid chrimatografy

A

-cromatografia liquida de alto rendimiento
-liquido-liquido
-hace uso de bombas de alta presion para mover las moleculas a traves de la columna
-ideal para analizar componentes no volatiles como tambien azucares, vitaminas, drogas y metabolitos

+analitica
+preparativa

-se pueden realizar curvas de calibracion con estandares de composicion y concentracion conocidas para observar los tiempos de retencion difinidos en la columna

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29
Q

HPLC
+analitica

A

determinar la composicion de la mezcla

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30
Q

HPLC
+preparativa

A

se pueden recuperar los componentes posteriormente a su analisis para estudios posteriores (ej. espectometria de masas -secuenciacion)

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31
Q

el área bajo la curva de cada pico es proporcional a la…

A

cantidad/concentracion (ej. mg/L) de cada componente en la mezcla analizada

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32
Q

electroforesis

A

-una de las herramientas moleculares fundamentales para aislar y purificar macromoleculas en base a su movilidad dentro de un soporte a matriz solida en un campo electrico
-2 tipos de muestra pueden ser analizados:

+acidos nucleicos
+proteinas

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33
Q

electroforesis en gel de poliacrilamida

A

-1 dimension (PAGE)
-2 dimensiones (2D)

34
Q

electroforesis en gel

A

-el medio de soporte es un gel
-2 tipos de geles:
+geles de poliacrilamida
+genes de agarosa

35
Q

electroforesis en gel
+geles de poliacrilamida

A

analisis principalmente de muestras de proteinas, aunque tambien para acidos nucleicos es posible en caso que se requiera mayor resolucion que la que brinda la agarosa

36
Q

electroforesis en gel
+geles agarosa

A

-analisis de muestras de acidos nucleicos
-en agarosa no pueden ser observadas diferencias pequeñas (p, ej. 20pb) en pesos moleculares de las moleculas analizadas

37
Q

movilidad electroforetica

A

-la movilidad de la molecula esta en fx de su peso molecular y su carga electrica principalmente
-son precisamente las diferentes movilidades que exhiben las diferentes macromoleculas las que permiten su separación

38
Q

en la electroforesis las moleculas siempre se mueven hacia ele electrodo de polaridad opuesta…

A

a la carga neta de la molecula (los cationes se mueven hacia el catodo y los aniones hacia el anodo)

39
Q

factores de la movilidad electroforetica

A

-factores intrinsecos de la molecula
-factores extrinsecos a la molecula

40
Q

-factores intrinsecos de la molecula

A

-carga electrica
-peso molecular

41
Q

factores extrinsecos a la molecula

A

-concentracion del gel (agarosa principalmente)
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-t°

42
Q

-factores intrinsecos de la molecula
relacion carga electrica/peso molecular

A

-a mayor relación carga electrica/peso molecular, mayor movilidad (u)

+proteinas: esta relacion no es constante
+acidos nucleicos: esta relacion es constante

43
Q

si la relación carga electrica/peso molecular es constante…

A

la movilidad “queda en fucion del peso molecular”, si este se incrementa la movilidad disminuye y viceversa

44
Q

movilidad electroforetica en gel:

A

en base al peso molecular de la macromolecular

45
Q

electroforesis de proteinas en gel tipos:

A

-electroforesis en 1 dimensión (PAGE)
-electroforesis en 2 dimensiones (2D)

46
Q

electroforesis en una dimensión

A

-gel concentrador- menor concentración
-gel separador-mayor concentración

47
Q

geles de poliacrilamida:

A
  1. acrilamida (C3H5NO)
  2. Bisacrilamida (N,N’-Methylenebisacrylamide) (c7h10n2o2)
48
Q

acrilamida (C3H5NO)

A

formación de polimeros

49
Q

bisacrilamida (N,N’-Methylenebisacrylamide) (c7h10n2o2)

A

entrecruzamiento (cross-linking) entre las cadenas de polimeros

50
Q

estructura primaria de las proteinas

A

-es la secuencia de una cadena de aa

51
Q

estructura secundaria de las proteinas

A

-ocurre cuando los aa en la secuencia interactuan a traves de enlaces de hidrogeno

52
Q

estructura terciaria de aminoacidos

A

-ocurre cuando ciertas atracciones estan presentes entre helices alfa y hojas plegadas

53
Q

estructura cuaternaria de las proteinas

A

-es una proteina que consiste de mas de una cadena de aa

54
Q

problemas a resolver

A
  1. las proteinas no tienen una relacion carga electrica/peso molecular constante
  2. la forma de la proteina influye en la movilidad (estructuras secundarias y cuaternarias)
    ej. proteinas globulares presentan mayor movilidad

+si las proteinas se analizan asi nada mas, se obtine un fraccionamiento (corrimiento electroforetico) que no obedece a la diferencia de peso molecular
+solucion 1 y 2: emplear SDS en la preparacion del gel poliacrilamida

  1. el corrimiento electroforetico observado puede representar a mas de una cadena polipeptidica

+solución: emplear agentes desnaturalizantes reductores

55
Q

SDS
sodium dodecil sulfate

A
  1. SDS sobre la relacion carga electrica/peso molecular
  2. SDS sobre la estructura proteina
56
Q
  1. SDS sobre la relacion carga electrica/peso molecular
A

-se una a las zonas apolares del polipeptido
-1 molecula de SDS por cada 2 residuos de aa, unos 1.4g SDS proteina
-ello proporciona al polipeptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena, por tanto, al peso molecular
-la carga negativa es mucho mayor que la carga original de la proteina

57
Q
  1. SDS sobre la estructura proteina
A

-agente desnaturalizante
-la repulsion electrostatica creada por la union del SDS rompe los enlaces covalentes haciando que la proteina pierda su conformación nativa
-se eliminan las diferencias en conformacion y su influencia sobre la movilidad de las diferentes proteinas que han de ser separadas en el gen

58
Q

puentes disulfuro en las proteinas

A

-las cisteinas en las proteinas pueden formar enlaces de disulfuro
-ayudan a estabilizar estructuras terciarias y cuaternarias
-además de que mantienen cierto plegamiento en las proteinas, afectan la interpretación de la electroforesis porque cabe la posibilidad de que 2 cadenas polipeptidicas independientes corran como si fueran una sola cadena de mayor peso molecular

59
Q

analisis de proteina multimericas

A
  1. ditiotreitol (DTT) o B-mercaptoetanol

-agentes desnaturalizantes reductor
*se puede determinar el numero y tamaño de subunidades proteinas comparando la electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras

60
Q

azul de bromofenol

A

-se adiciona al buffer de carga de la muestra
-permite visualizar el corrimiento electroforetico
-carga negativa por encima de ph 4.6
-peso molecular menor que culaquier proteina

61
Q

determinacion del tamaño de la proteina

A

-inicio de la corrida (donde inicia el gel separador)

-frente de corrida (linea donde llega el azul de bromofenol)

62
Q

revelado del gel. metodos de tinción

A

-azul de coomassie (coomassie brilliant blue) puede detectarse bandas de hasta 5ng
-tinción de plata (silver stanning): incrementa la sensibilidad de deteccion (50x)

63
Q

electrofororesis en 2 dimensiones

A

-1ra dimension: separacion por punto isoelectrico (isoelectroenfoque)
-2da dimensión: separacion de tamaño (peso molecular)

64
Q

punto isoelectrico

A

-es el ph al que un polianfolitico tiene carga neta cero

65
Q

polianfolitos

A

son moleculas grandes como las proteinas que tienen muchos grupos acidos o basicos (ionizables/protonables)

66
Q

una molecula con un PI bajo tendra

A

predominantemente grupos acidos

67
Q

un PI alto indica

A

predominancia de grupos basicos

68
Q

pepsin

A

-1.0

69
Q

egg albumin

A

4.6

70
Q

serum albumin

A

4.9

71
Q

ureasa

A

5.0

72
Q

b-lactoglobulin

A

5.2

73
Q

hemoglobin

A

6.8

74
Q

mioglobin

A

7.0

75
Q

chymotrysinogen

A

9.5

76
Q

cytocromo c

A

10.7

77
Q

lisosima

A

11

78
Q

proteomica cuantitativa

A

-estudio de las variaciones de los niveles de expresion a nivel de la proteina en determinados momentos y bajo ciertas condiciones de la celula que permite identificar aquellas proteinas cuya presencia, ausencia o alteracion se correlaciona con determinados estadios fisiologicos
-en el analisis proteomico asociado a patologias concretas, es posible indetificar proteinas que permiten diagnosticar la enfermedad o pronosticar la evolucion de la misma, dichas proteinas se conocen como nombre generico de BIOMARCADORES

79
Q

proteoma

A

conjunto completo de proteinas de un organismo

80
Q

proteinas expresadas en 2 tejidos

A

-las diferencias entre las 2 muestras de tejido superan ampliamente sus similitudes: incluso para proteinas que se comparten entre los 2 tejidos, sus abundancias relativas son generalmente diferentes

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