Purificación de proteínas Flashcards
con cada paso de purificacion la cantidad de muestra…
se hace mas pequeña (la actividad especifica va siendo mayor)
purificacion de proteinas:
-cromatografia:
+en papel
+en capa fina
+en columna
+de intercambio ionico
+de exclusion molecular
+de afinidad
+cromatografia liquida de alto rendimiento
-electroforesis en gel de poliacrilamida
+1 dimension PAGE
+2 dimensiones 2D
cromatografía
-tecnica para fraccionar mezclas organidas (P,C,L y aplicaciones concretas en acidos nucleicos) al desplazarse a traves de la matriz
-metodo de separacion en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de particion entre una fase movil y una fase estacionaria para separar los componentes de una mezcla
coeficiente de partición
-cociente entre las concentraciones de una sustancia en las 2 fases formadas por 2 disolventes inmisibles en equilibrio
-mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos 2 disolventes
un soporte (matriz) mantienen sostenida la fase estacionaria…
y la fase movil acarrera la muestra
los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria…
tendran un tiempo de retencion (desde la entrada hasta el detector/salida) mayor
influencia de efectos contrapuestos
-retencion
-desplazamiento
influencia de efectos contrapuestos
retención
efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un solido o un liquido anclada a un soporte solido
influencia de efectos contrapuestos
desplazamiento
efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil (eluyente), que puede ser un liquido o un gas
elución/eluir
migración/migrar de los componentes de una mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil
tipos de comatografía
dependiendo de la naturaleza de las fases estacionaria y movil
+s-l
+l-l
+l-g
+s-g
solido-liquido
fase estacionaria es un solido y la movil es una liquido
liquido-liquido
fase estacionaria es un liquido anclado a un soporte solido y la movil es un liquido
liquido-gas
fase estacionaria es un liquido no volatil impregnado en un solido y la fase movil es un gas (p. ej. helio, para lipidos)
solido-gas
fase estacionaria es un solido y la movil es un gas
cromatografia en papel
-fase estacionaria: papel filtro
-version primitiva de la capa fina
-para aa individuales o dipéptido
-empleada por sanger (1945) en la secuenciación de la insulina
cromatografia en capa fina
-fase estacionaria: placa adsorbente, los mas usados sílica gel (SiO2) y alumina (Al2O3), adherido a un soprte de plástico, vidrio o aluminio
cromatografia en columna
-fase estacionaria (ej. silica gel o alumina) se empaqueta en una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases
-la muestra se aplica en la parte sup de la columna y se aluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades
cromatografia en columna
ej
-un eluyente polar desplzara las moleculas mas polares rapidamente a traves de la columna
-si el eluyente es muy polar la elucion sera muy rapida y generalmente habra poca separación
cromatografia en columna
2
-componentes que eluyen a diferentes velocidades podran ser separados
-se colectan fracciones de determinados volumenes y se produce a identificar la fracción enriquecida con el/ los eluato (s) de interés
-los componentes puede ser colectados para su analisis post
cromatografia de intercambio iónica
-aprovecha las diferentes en signo y magnitud de las cargas que tienen las moleculas como las proteinas a distinto ph
-el mecanismo basico es el intercambio reversible de los iones de solución con los grupos funcionales cargadas( con carga) unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
+intercambio cationico
+intercambio anionico
intercambio cationico (resina carga negativa)
-fuerte: acido sulfonico
-debil: acido carboxilico
intercambio anionico (resina carga positiva)
-fuerte: aminas cuaternarias
-debil: aminas secundarias o terciarias
intercambio ionico de peptidos
-separacion se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentracion de sales de la fase movil para crear un gradiente
-moleculas con carga opuesta a la matriz migraran mas lentamente que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria
cromatografia de exclusion molecular
o filtración en gel
-fase estacionaria: material poroso interno
-separacion del soluto segun su tamaño y estructura molecular
+las moleculas pequeñas entran en el laberinto de los espacios dentro de la matriz y son retrasadas
+las moleculas grandes no entran dentro de las cavidades de la matriz y atraviesan mas libremente recuperandose en las primeras fracciones
cromatografia de afinidad
-de mayor especificas y selectividad para la purificacion de biomoleculas
-se basa en la interacción especifica de 2 moleculas:
+antigeno/anticuerpo
+enzima/sustrato
+receptor/ligando
-una de ellas se une a la fase estacionaria
cromatografia de afinidad
2
-las moleculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria se liberan mediante un cambio del medio eluyende a condiciones en las que la interaccion se debilite:
+ph (lo que afecta el estado de ioniacion de las biomoleculas)
+fuerza ionica (concentración de sales, afecta las interacciones ionicas)
+polaridad (solubilidad)
+solucion de las moleculas inmovilizadas
HPLC
high performance liquid chrimatografy
-cromatografia liquida de alto rendimiento
-liquido-liquido
-hace uso de bombas de alta presion para mover las moleculas a traves de la columna
-ideal para analizar componentes no volatiles como tambien azucares, vitaminas, drogas y metabolitos
+analitica
+preparativa
-se pueden realizar curvas de calibracion con estandares de composicion y concentracion conocidas para observar los tiempos de retencion difinidos en la columna
HPLC
+analitica
determinar la composicion de la mezcla
HPLC
+preparativa
se pueden recuperar los componentes posteriormente a su analisis para estudios posteriores (ej. espectometria de masas -secuenciacion)
el área bajo la curva de cada pico es proporcional a la…
cantidad/concentracion (ej. mg/L) de cada componente en la mezcla analizada
electroforesis
-una de las herramientas moleculares fundamentales para aislar y purificar macromoleculas en base a su movilidad dentro de un soporte a matriz solida en un campo electrico
-2 tipos de muestra pueden ser analizados:
+acidos nucleicos
+proteinas
electroforesis en gel de poliacrilamida
-1 dimension (PAGE)
-2 dimensiones (2D)
electroforesis en gel
-el medio de soporte es un gel
-2 tipos de geles:
+geles de poliacrilamida
+genes de agarosa
electroforesis en gel
+geles de poliacrilamida
analisis principalmente de muestras de proteinas, aunque tambien para acidos nucleicos es posible en caso que se requiera mayor resolucion que la que brinda la agarosa
electroforesis en gel
+geles agarosa
-analisis de muestras de acidos nucleicos
-en agarosa no pueden ser observadas diferencias pequeñas (p, ej. 20pb) en pesos moleculares de las moleculas analizadas
movilidad electroforetica
-la movilidad de la molecula esta en fx de su peso molecular y su carga electrica principalmente
-son precisamente las diferentes movilidades que exhiben las diferentes macromoleculas las que permiten su separación
en la electroforesis las moleculas siempre se mueven hacia ele electrodo de polaridad opuesta…
a la carga neta de la molecula (los cationes se mueven hacia el catodo y los aniones hacia el anodo)
factores de la movilidad electroforetica
-factores intrinsecos de la molecula
-factores extrinsecos a la molecula
-factores intrinsecos de la molecula
-carga electrica
-peso molecular
factores extrinsecos a la molecula
-concentracion del gel (agarosa principalmente)
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-t°
-factores intrinsecos de la molecula
relacion carga electrica/peso molecular
-a mayor relación carga electrica/peso molecular, mayor movilidad (u)
+proteinas: esta relacion no es constante
+acidos nucleicos: esta relacion es constante
si la relación carga electrica/peso molecular es constante…
la movilidad “queda en fucion del peso molecular”, si este se incrementa la movilidad disminuye y viceversa
movilidad electroforetica en gel:
en base al peso molecular de la macromolecular
electroforesis de proteinas en gel tipos:
-electroforesis en 1 dimensión (PAGE)
-electroforesis en 2 dimensiones (2D)
electroforesis en una dimensión
-gel concentrador- menor concentración
-gel separador-mayor concentración
geles de poliacrilamida:
- acrilamida (C3H5NO)
- Bisacrilamida (N,N’-Methylenebisacrylamide) (c7h10n2o2)
acrilamida (C3H5NO)
formación de polimeros
bisacrilamida (N,N’-Methylenebisacrylamide) (c7h10n2o2)
entrecruzamiento (cross-linking) entre las cadenas de polimeros
estructura primaria de las proteinas
-es la secuencia de una cadena de aa
estructura secundaria de las proteinas
-ocurre cuando los aa en la secuencia interactuan a traves de enlaces de hidrogeno
estructura terciaria de aminoacidos
-ocurre cuando ciertas atracciones estan presentes entre helices alfa y hojas plegadas
estructura cuaternaria de las proteinas
-es una proteina que consiste de mas de una cadena de aa
problemas a resolver
- las proteinas no tienen una relacion carga electrica/peso molecular constante
- la forma de la proteina influye en la movilidad (estructuras secundarias y cuaternarias)
ej. proteinas globulares presentan mayor movilidad
+si las proteinas se analizan asi nada mas, se obtine un fraccionamiento (corrimiento electroforetico) que no obedece a la diferencia de peso molecular
+solucion 1 y 2: emplear SDS en la preparacion del gel poliacrilamida
- el corrimiento electroforetico observado puede representar a mas de una cadena polipeptidica
+solución: emplear agentes desnaturalizantes reductores
SDS
sodium dodecil sulfate
- SDS sobre la relacion carga electrica/peso molecular
- SDS sobre la estructura proteina
- SDS sobre la relacion carga electrica/peso molecular
-se una a las zonas apolares del polipeptido
-1 molecula de SDS por cada 2 residuos de aa, unos 1.4g SDS proteina
-ello proporciona al polipeptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena, por tanto, al peso molecular
-la carga negativa es mucho mayor que la carga original de la proteina
- SDS sobre la estructura proteina
-agente desnaturalizante
-la repulsion electrostatica creada por la union del SDS rompe los enlaces covalentes haciando que la proteina pierda su conformación nativa
-se eliminan las diferencias en conformacion y su influencia sobre la movilidad de las diferentes proteinas que han de ser separadas en el gen
puentes disulfuro en las proteinas
-las cisteinas en las proteinas pueden formar enlaces de disulfuro
-ayudan a estabilizar estructuras terciarias y cuaternarias
-además de que mantienen cierto plegamiento en las proteinas, afectan la interpretación de la electroforesis porque cabe la posibilidad de que 2 cadenas polipeptidicas independientes corran como si fueran una sola cadena de mayor peso molecular
analisis de proteina multimericas
- ditiotreitol (DTT) o B-mercaptoetanol
-agentes desnaturalizantes reductor
*se puede determinar el numero y tamaño de subunidades proteinas comparando la electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras
azul de bromofenol
-se adiciona al buffer de carga de la muestra
-permite visualizar el corrimiento electroforetico
-carga negativa por encima de ph 4.6
-peso molecular menor que culaquier proteina
determinacion del tamaño de la proteina
-inicio de la corrida (donde inicia el gel separador)
-frente de corrida (linea donde llega el azul de bromofenol)
revelado del gel. metodos de tinción
-azul de coomassie (coomassie brilliant blue) puede detectarse bandas de hasta 5ng
-tinción de plata (silver stanning): incrementa la sensibilidad de deteccion (50x)
electrofororesis en 2 dimensiones
-1ra dimension: separacion por punto isoelectrico (isoelectroenfoque)
-2da dimensión: separacion de tamaño (peso molecular)
punto isoelectrico
-es el ph al que un polianfolitico tiene carga neta cero
polianfolitos
son moleculas grandes como las proteinas que tienen muchos grupos acidos o basicos (ionizables/protonables)
una molecula con un PI bajo tendra
predominantemente grupos acidos
un PI alto indica
predominancia de grupos basicos
pepsin
-1.0
egg albumin
4.6
serum albumin
4.9
ureasa
5.0
b-lactoglobulin
5.2
hemoglobin
6.8
mioglobin
7.0
chymotrysinogen
9.5
cytocromo c
10.7
lisosima
11
proteomica cuantitativa
-estudio de las variaciones de los niveles de expresion a nivel de la proteina en determinados momentos y bajo ciertas condiciones de la celula que permite identificar aquellas proteinas cuya presencia, ausencia o alteracion se correlaciona con determinados estadios fisiologicos
-en el analisis proteomico asociado a patologias concretas, es posible indetificar proteinas que permiten diagnosticar la enfermedad o pronosticar la evolucion de la misma, dichas proteinas se conocen como nombre generico de BIOMARCADORES
proteoma
conjunto completo de proteinas de un organismo
proteinas expresadas en 2 tejidos
-las diferencias entre las 2 muestras de tejido superan ampliamente sus similitudes: incluso para proteinas que se comparten entre los 2 tejidos, sus abundancias relativas son generalmente diferentes
