Enzimas de restricción, ligasas y polimerasas Flashcards
cortan o degradan los ácidos nucleicos hidrolizando el enlace fosfodiester de nucleótidos contiguos
nucleasas
exonucleasas actuan
en los extremos 5’ 3’
endonucleasas actuan
sobre los enlaces internos
unen moleculas de dna
ligasas
sintetizan acidos nucleicos
polimerasas
-endodeoxirribonucleasas
-tienen la capacdad de cortar DNA doble cadena en una secuencia especifica
-warner arber, hamilton smith y daniel nathans en 1978
-en la actualidad se conocen miles de ellas con mas de 100 diferentes sitios de reconocimiento
endonucleasas de restricción
sistema de defensa bacteriana contra patogenos, protegiendolas del ataque de DNA foraneo (ej bacteriofago)
-restricción
-metilación
-ambas cadenas reconocen la misma secuencia de bases
endonucleasa que corta dna doble cadena rompiendo uniones fosfodiester dentro o fuera de la secuencia de reconocimiento
restricción
metilasa que modifica al dna por metilacion en una base determinada siempre dentro de la secuencia de reconocimiento
metilación
la metilacion de las 2 hebras del dna evita que la …
enzima de restriccion pueda cortar la molecula de DNA
la__________protege el dna genomico y plasmidico bacteriano del ataque de sus propias enzimas
metilación
si ambas cadenas estan metiladas
no hay ni metilacion ni restricción
si solo una cadena esta metilada
hay metilación y no restricción
si ninguna cadena esta metilada
no hay metilacion, si restriccion
el sistema de restricción modificación sirve como:
sistema inmune
bacteria EcoRI+ (met)
Hindlll-
hay lisis bacteriana
bacteria EcoRl - Hindlll+
no hay lisis bacteriana
bacteria EcoRl+ Hindlll- (met)
no hay lisis bacteriana
digestion con enzimas de restricción puede producir 2 tipos de cortes:
-extremos cohesivos o pegajosos
-extremos abruptos(romo)
-corte de manera escalonada en dos puntos diferentes, pueden ser unidos (ligados) nuevamente.
-si provienen de la digestion de 2 secuencias diferentes (ya sea con la misma enzima o con enzimas con extremos compatibles) se generara una nueva secuencia final (dna recombinante
extremos cohesivos o pegajosos
-corte en un solo punto en ambas cadenas
extremos abruptos (romo)
son distintas enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia, con distintas especificidades
isoesquizomeros
enzimas de restriccion que reconocen distintas secuencias pero dejan los mismos extremos
BamHl
Bglll
enzimas con extremos compatibles
mapa de restricción
-muestra en una secuencia de bases todos los posibles sitios de corte para las enzimas de restricción conocidas
-se emplean programas informativos para obtenerlo
-nos permite seleccionar la enzima adecuada para editar la secuencia original y al final obtener la secuencia deseada
-los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción pueden verse alterados por variación en la secuencia del dna
-esta variación se secuencia es inherente en regiones polimorficas (varian entre individuos y sirven como marcador genetico) o puede deberse a mutacion
variación de los patrones de corte
RFLPs es
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
segmentos de dna doble cadena producidos por la accion de una endonucleasa de restricción sobre un DNA mas largo
fragmentos de restricción
procedimiento de RFLPs
-extracción de DNA de diferentes individuos
-amplificacion por PCR de la secuencia polimorfica y/o potencialmente mutante
-digestion empleando varias enzimas de restricción por separado y/o diferentes juegos de enzimas
-separación e identificación del numero de fragmentos y sus distintas longitudes (tamaños) por electroforesis en gel agarosa
-interpretación
RFLPs en rasgos fenotipicos recesivos:
un sitio de restricción (marcador genetico) puede estar geneticamente ligado a una mutación que lo produce
los fragmetos de restriccion del hijo estan presentes en los fragmentos de restricción de:
la madre y del padre
-es una enzima que tiene como fx corregir las discotinuidades en la hebra de DNA generadas en la replicacion (cadena retrasada), reparación de errores en la replicación o bien daño al dna
-su papel en la biologia molecular es catalizar la union de fragmentos distintos de dna, tanto si poseen extremos romos o cohesivos, obteniendose el correspondiente dna recombinante
-forma enlaces covalentes entre el extremos 5’-fosfato de una cadena polinucleotidica y el extremo 3’-oh de otra cadena polinucleotidica
ligasa
en una ligasa un enlace fosfodiester es formado a
expensas de otro
la ligación a extremos cohesivos requiere:
complementariedad de secuencia
la ligación de extremos romos no requiere
de secuencias complementarias
2 extremos romos cualquiera pueden ser unidos por
la dna ligasa
la eficiencia de ligación de extremos cohesivos es _______ que la de extremos romos
mayor
-requeridas para los ciclos repetidos de desnaturalización (calentamiento) y polimerización del DNA
-provienen de organismos cuyas enzimas son resistentes a las altas temperaturas
dna polimerasas termpoestables
