Cultivo celular Flashcards
cultivo celular
conjunto de tecnicas que permiten el mantenimiento de las células ‘in vitro’, manteniendo al máximo sus propiedades fisiologicas, bioquimicas y genéticas
in vitro
se refiere a una tecnica para realizar un eterminado experimento en una ambiente controlado fuera de un organismo vivo
cultivo celular
-cultivo bacteriologico
-cultivo celular
cultivo bacteriologico
-microorganismos
-bacterinas, hongos y parasitos
cultivo celular
-celulas eucariotas (ej. organismos pluricelulares)
-sin embargo (unicelulares)
+protozoarios (paramecios, plasmodium, amebas)
+levaduras (hondos microscopicos unicelulares)
-en medicina se referiria a celulas representantes de un tipo celulas especifico (humano o especie de interes)
ciclo de crecimiento microbiano
-curva que describe en ciclo entero de cremiento
-es el reflejo de eventos poblaciones no de celulas individuales
-en general las celulas procariotas crecen más rápido que las eucariotas
fases del ciclo de crecimiento:
-latencia
-exponencial
-estacionaria
-muerte
fase de latencia
-tiempo que tarda en comenzar el crecimiento de un microorganismo tras ser inoculado en medio fresco
-depende de la historia del inóculo, la naturaleza del medio y las condiciones de crecimiento
fl
si un inoculo es fase exponencial se transfiere a medio fresco bajo las mismas condiciones de crecimiento…
no hay esencialmente fase de latencia y prosigue la fase exponencial
fl
si un inoculo proviene de un cultivo viejo, las células están depletas de constituyentes esenciales…
para el crecimiento, se llevara tiempo sintetizarlos
fl
si el medio cambia y se disponen de otros sustratos como fuentes de carbono por ejemplo…
se requiere sintetizar las enzimas que permitiran aprovecharlos, eso lleva tiempo
fase exponencial
-es el estado más saludable de las células
-ideal para el estudio de enzimas u otros componentes celulares
-el numero de células se duplica en intervalos constantes de tiempo
-en un cultivo por lote (tubo cerrado), los organismos no crecen indefinidamente de forma exponencial
un cultivo solo permanece en fase exponencial por un tiempo limitado:
-10 generaciones
1 bacteria pesa:
1x10^-15kg
peso de la tierra:
6x10^24
fase estacionaria
-en realidad la fase estacionaria comienza por agotamiento de nutrientes o acumulación de desechos
-crecimiento crítico en fase estacionaria, no hay incremento neto en el número de células, algunas crecen mientras otras mueren
fase de muerte
-es tambien exponencia, pero tipicamente mas lenta que la exponencial de crecimiento
-las celulas pueden permanecer viables durante meses o incluso años
monitoreo del rendimiento de cultivos por
-las celulas dispersan la luz
-la turbidez de una suspension celular aumenta en la medida en que hay mas celulas presentes
-se mide la luz que atraviesa la suspension sin ser dispersada
espectrofotometria
-2 organismos (tipos celulares):
+pueden tener densidades ópticas diferentes a tiempos similares de medición por diferencias en tamaños y formas o en velocidades de crecimiento
+el mismo valor de OD no necesariamente corresponde al mismo número de células
cuando la turbidez es escesiva se pierde la correspondencia entre el número de células…
y la densidad óptica porque la luz dispersada de la fotocelda por una célula puede ser nuevamente enviada a la fotocelda por otra célula
el cultivo celular a sido desarrollado gracias a:
-medios de cultivo (mucho mas complejos que para cultivo bacteriologico)
-disponibilidad de antibioticos
-instalaciones asépticas (salas, cabinas de flujo laminar, incubadoras)
-dispositivos de cultivo (frascos T, cajas petri)
medios de cultivo
-tamponados para mantener un PH alrededor de 7.4
-indicadores de ph (rojo fenol), cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos resultando del metabolismo celular
-antibioticos (ej. penicilina, estrreptomicina) y antimicoticos (anfotericina) para impedir la contaminacion
medios de cultivo con suero:
-mezcla poco definida de macromoleculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo
medios de cultivo libres de suero:
-quimicamente definidos con moleculas necesarias para la supervivencia y proliferacion como los factores de crecimiento
condiciones de cultivo celular
-incubacion a 37° en una atmosfera de 5% de CO2, 95% aire
-frasco T. un recipiente tipico de 175cm2 puede contener aproximadamente 1x10^7 celulas adheridas y unas 1x10^8 celulas cuando se trata de lineas que crecen en suspención
tipos de cultivo
-primarios
+monocapa
+suspencion
-secundarios
-lineas celulares (continuos)
-hibridomas
cultivos primarios
-se preparan directamente a partir de un tejido u organo
-con o sin fraccionamiento previo para separar los disntintos tipos celulares
-las celulas conservan sus caracteristicas originales y su proliferacion es limitada
-pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
cultivos primarios
monocapa
-la mayoria de las celulas que forman los tejidos (a diferencia de las bacterias) no pueden vivir en suspencion, y requieren una superficie solida sobre la cual crecer y multiplicarse (anclaje-deoendiente)
-excepto las hematopoyaticas maduras
-confluencia: el area de anclaje disponible se haya toda cubiera de celulas
-este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plastico
-a veces los requerimientos son mas complejos y el plastico debe recubrirse con componentes de la matriz extracelular que rodea a las celulas en los tejidos, como colageno y laminina
cultivo primario
suspencion
-celulas dispersas en el medio de cultivo
-alcanzan confluencia cuando el numero de celulas es grande y los nutrientes insuficientes
cultivos secundarios:
-las celulas en monocapa confluente detienen su crecimeitno hasta que se las subcultiva (resiembra) a un recupiente con medio fresco
-las celulas frecuentemente mostraran distinas propiedades segun su origen:
+fibroblastos (mantienen la matriz extracelular en animales) secretran colageno
+celulas derivadas de tejido muscular esqueletico se fusionaran para generar firbas musculares con capacidad contractil espontanea
+celulas nerviosas extenderan prolongaciones
(axones) alectricamente excitables que podran establcer sinapsis con otras celulas
lineas celulares
-transformación: inmortales, crecimiento aberrante (sin inhicion por contacto, ni anclaje-dependiente), malignas (diseminan e invaden), geneticamente inestables (anomalias/aberraciones cormosomicas numericas -aneuploides- y/o estructurales -ek. delecion, duplicacion)
-no todas las celulas humanas se transforman asi
-otra forma es introducir ciertos oncogenes (genes promotore de cancer) obtenidos de virtus (ej.hpv)
-las celulas de los roedores experimentan cambios geneticos espontaneos que las inmortalizan cuando son cultivadas
fibroblastos humanos normales se dividen entre 25 y 40 veces en el cultivo, se les puede inmortalizar si se les provee…
del gen que codifica para la telomerasa
HeLa (henrietta Lacks)
1952
primera linea celular humana
adenocarcinoma
cultivo celular: ventajas
-pueden ser conservadas y almacenadas en nitrogeno líquido (a 196°C) por un largo tiempo manteniendo su viabilidad
inestabilidad genetica
heterogeneidad
hibrodimas
-cesar milstein. premio nobel de medicina
-produccion de anticuerpos monoclonales
-fusion de linfocitos B secretores de Ig (anticuerpos) y celulas derivadas de una linea tumoral de linfocitos B
-fusogeno: ej. polietilenglicol
-heterocarionte
heterocarionte:
celulas con nucleos geneticamente diferentes separados pero con los contenidos citoplasmaticos compartidos
HAT
-hipoxantina
-aminopterina
-timidina
medio selectivo HAT
-aminopterina es un antagonista competitivo delacido dihidrofolico, vitamina necesaria en la sintesis de nucleotidos
-las celulas deben utilizar vias alternas para la sintesis de DNA
-estas vias alternas son defectivas en la linea celular tumoral pero estan intacta en las celulas de bazo
-solo celulas hibridas sobreviven
-HGPRT
-TQ
HPGRT
hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
TQ
timidinoquinasa
un heterocarionte puede entrar en mitosis…
produciendo una celulas hibrida en la cual las envolturas de ambos nucleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único gran núcleo
cada clon de celulas fusionadas produce…
un anticuerpo monoclonal y prolifera indefinidamente
el anticuerpo monoclonal…
reconoce un único epítope antigénico
epitope
region de la molecula del antigeno que es reconocida por el anticuerpo
