Secuenciación de proteinas y cristalografia

Question 1

flujo de trabajo

Answer 1

1. extraccion de proteinas
2. separacion de proteinas
3. procesamiento para secuenciacion

Question 2

1. extraccion de proteinas

Answer 2

cuantificacion, p. ej. bradford

Question 3

2. separacion de proteinas

Answer 3

sds page
2d-criterio de pureza
cromatografia de exclusion molecular, afinidad o intercambio ionico

Question 4

3. procesamiento para secuenciacion

Answer 4

-agentes reductores (eliminar puentes disulfuro)
-alquilacion de cisteinas (evitar pueden disulfuro)
-hidrolisis completa permite determinar cules aa estan presentes y en que proporcion
-digestiones individuales con 2 diferentes gentes para obtener peptidos menores a 3kda, purificacion de fragmentos, secuenciacion de fragmentos, determinacion de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales

Question 5

especificidad de algunos metodos para la fragmentacion de cadenas polipeptidicas

Answer 5

-todas son proteasas exceoti dek bromuro de cianogeno
-la ruptura puede ocurrir ya sea en el extremo carboxilo (C) o en el amino (N) de aa indicado

Question 6

cyanogen bromide no es:

Answer 6

un proteasa

Question 7

secuenciación de proteinas:

Answer 7

-reacciones para identificar el aa N-t
+sanger
+edman

-espectrometria de masas
+maldi (matrix assited laser desorption/ ionizacion)
+esi (electrospray ionization)
+ms/ms (tandem ms)

Question 8

secuenciacion de sanger
reactivo de sanger

Answer 8

2,4-dinitro-fluouro-fenilo

Question 9

degradacion de edman

Answer 9

-reactivo de edman: fenilisotiocianato
-se obtiene la feniltiohidantoina de aa n-terminal y queda el resto del peptido intacto

Question 10

degradacion de edman
x2

Answer 10

-empleada en secuanciadores automaticos
-estos equipos solo pueden secuenciar los -40 primero aa del extremo n-t
-el rendimiento de la reaccion no es del 100% y pierde el peptido poco a poco y al final no queda nada
-suele ser suficiente para confirmar la identidad de una proteiina conocida recien pruficada al confrontar al info con las bases de datos
-se puede hidrolizar la proteina original y realizar la secuenciacion de cada fragmento por separadoo

Question 11

3 componentes basicos de la espectromeria de masas:

Answer 11

1. sistema de ionizacion
2. analizador de masas
3. detector de iones

Question 12

1. sistema de ionizacion

Answer 12

-vaporizacion (moleculas en fase gaseosa) e ionizacion a partir de moleculas neutras
-requieren muy poca cantidad de muestra ng (ej. spot del 2d)

Question 13

2. analizador de masas

Answer 13

-separación de los iones en fx de su relacion masa/carga electrica (m/z) utilizando campos electromagneticos en el vacio
-permite deducir la masa de la molecula con mucha precision

Question 14

3. detector de iones

Answer 14

-deteccion de iones formados y registro adecuado de la info

Question 15

sistemas de ionizacion
maldi

Answer 15

muestras en fase solida

Question 16

sistemas de ionizacion
esi

Answer 16

muestras en fase liquida

Question 17

analizadores de masas ej

Answer 17

-tof (time of flight)
-tof-tof
-trampa de iones tridimensional (ion traf)
-q(quadruplo)

Question 18

tof

Answer 18

-la muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de tiempo de vuelo (tof)
-para una energia determinada, los iones mas pesados se desplazan mas lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa

Question 19

tof-tof

Answer 19

-se puede abrir y cerrar rapidamente la compuerta de paso entre el primer tubo (drift tube)y el tof tube
-el aislamiento no funciona cuando el espectro esta demasiado congestionado

Question 20

trampa de iones

Answer 20

-los iones son atrapados aplicando una radiofrecuencia en la direccion radial y un potencial continuo repulsivo en la lente de salida
-despues de que se acumulan, los iones salen de la trampa mediante un voltaje auxiliar

Question 21

quadrupolo

Answer 21

-4 barras metalicas de seccion circular hiperbolica, rectas y paralelas
-por pares alternos se aplica un potencial constante v que origina un movimiento lat oscilante de los iones
-bajo ciertas condiones de potencial, determinado ion puede moverse sin chocar con las barras e ingresar al detector
-funciona como un verdadero filtro de masas

Question 22

ms/ms

Answer 22

-esencialmente 2 espectrometros en tandem

Question 23

deteccion de iones e interpretacion

Answer 23

-se detecta un flujo ionico, se amplific y se transmite a la computadora, donde se registra en forma de un espectro de masas
-en la interpretacion se pueden incluso determinar cofactores unidos, iones metalicos o modificaciones covalentes

Question 24

la masa de los iones en el eje de las absisas y

Answer 24

la intesidad (abundancia) de los mismos en el eje de las ordenadas

Question 25

el espectro de masa evidencia el numero de componentes en la muestra y

Answer 25

el peso molecular de cada componente

Question 26

cristalografia de rayos x

Answer 26

-metodo para determinar la estructura tridimensional de una macromolecula (ej. proteina) mediante el analisis de difraccion de los rayos x por un compuesto cristalino
-determina la separacion de los atomos en una red cirstalina mediendo las ubicaciones de manchas producidas en una pelicula fotografica por un haz de rayos difractado

Question 27

resolucion, de forma general

Answer 27

distancia minima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

Question 28

resolucion, de forma importante

Answer 28

depende de la longitud de onda de la luz

Question 29

a menor onda de luz

Answer 29

mayor resolucion

Question 30

un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede…

Answer 30

utilizarse para examinar detalles estructurales mas pequeños que su propia onda

Question 31

distancia entre los puntos que resuelven
ojo humano

Answer 31

0.2mm

Question 32

distancia entre los puntos que resuelven
microscopio optico

Answer 32

0.2 um

Question 33

distancia entre los puntos que resuelven
microscopio electronico de barrido

Answer 33

2.5 um

Question 34

distancia entre los puntos que resuelven
microscopio electronico de transmicion

Answer 34

1.0 um

Question 35

los rayos x tienen longitudes de onda comparables a las

Answer 35

distancias atomico (0.1 nm)-moleculares (10nm (1x10-9)) a 10 picometros (1x10-12 metros).
se producen al someter una carga eletruca a una aceleracion (lanzar electrones sobre un metal)

Question 36

los electrones de la macromolecula en estudio (proteina) emiten a su vez rayos X

Answer 36

-los electrones oscilan (se aceleran) conforme pasa la onda
-la emision en todas direcciones

Question 37

las emisiones de varios electrones experimentan interferencia en diferentes direcciones

Answer 37

a. interferenciia constructiva
b. interferencia destructiva

Question 38

a. interferenciia constructiva

Answer 38

en la pantalla aparece una mancha

Question 39

b. interferencia destructiva

Answer 39

en la pantalla no hay señal

Question 40

la amplitud de las ondas se incrementa cuando

Answer 40

se encuentran en fase

Question 41

regiones brillantes

Answer 41

interferencias constructivas

Question 42

regiones oscuras

Answer 42

interferencias destructivas

Question 43

las distancias en las manchas son inversamente proporcional a

Answer 43

las distancias en la red real