Secuenciación de proteinas y cristalografia Flashcards
flujo de trabajo
- extraccion de proteinas
- separacion de proteinas
- procesamiento para secuenciacion
- extraccion de proteinas
cuantificacion, p. ej. bradford
- separacion de proteinas
sds page
2d-criterio de pureza
cromatografia de exclusion molecular, afinidad o intercambio ionico
- procesamiento para secuenciacion
-agentes reductores (eliminar puentes disulfuro)
-alquilacion de cisteinas (evitar pueden disulfuro)
-hidrolisis completa permite determinar cules aa estan presentes y en que proporcion
-digestiones individuales con 2 diferentes gentes para obtener peptidos menores a 3kda, purificacion de fragmentos, secuenciacion de fragmentos, determinacion de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales
especificidad de algunos metodos para la fragmentacion de cadenas polipeptidicas
-todas son proteasas exceoti dek bromuro de cianogeno
-la ruptura puede ocurrir ya sea en el extremo carboxilo (C) o en el amino (N) de aa indicado
cyanogen bromide no es:
un proteasa
secuenciación de proteinas:
-reacciones para identificar el aa N-t
+sanger
+edman
-espectrometria de masas
+maldi (matrix assited laser desorption/ ionizacion)
+esi (electrospray ionization)
+ms/ms (tandem ms)
secuenciacion de sanger
reactivo de sanger
2,4-dinitro-fluouro-fenilo
degradacion de edman
-reactivo de edman: fenilisotiocianato
-se obtiene la feniltiohidantoina de aa n-terminal y queda el resto del peptido intacto
degradacion de edman
x2
-empleada en secuanciadores automaticos
-estos equipos solo pueden secuenciar los -40 primero aa del extremo n-t
-el rendimiento de la reaccion no es del 100% y pierde el peptido poco a poco y al final no queda nada
-suele ser suficiente para confirmar la identidad de una proteiina conocida recien pruficada al confrontar al info con las bases de datos
-se puede hidrolizar la proteina original y realizar la secuenciacion de cada fragmento por separadoo
3 componentes basicos de la espectromeria de masas:
- sistema de ionizacion
- analizador de masas
- detector de iones
- sistema de ionizacion
-vaporizacion (moleculas en fase gaseosa) e ionizacion a partir de moleculas neutras
-requieren muy poca cantidad de muestra ng (ej. spot del 2d)
- analizador de masas
-separación de los iones en fx de su relacion masa/carga electrica (m/z) utilizando campos electromagneticos en el vacio
-permite deducir la masa de la molecula con mucha precision
- detector de iones
-deteccion de iones formados y registro adecuado de la info
sistemas de ionizacion
maldi
muestras en fase solida
sistemas de ionizacion
esi
muestras en fase liquida
analizadores de masas ej
-tof (time of flight)
-tof-tof
-trampa de iones tridimensional (ion traf)
-q(quadruplo)
tof
-la muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de tiempo de vuelo (tof)
-para una energia determinada, los iones mas pesados se desplazan mas lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
tof-tof
-se puede abrir y cerrar rapidamente la compuerta de paso entre el primer tubo (drift tube)y el tof tube
-el aislamiento no funciona cuando el espectro esta demasiado congestionado
trampa de iones
-los iones son atrapados aplicando una radiofrecuencia en la direccion radial y un potencial continuo repulsivo en la lente de salida
-despues de que se acumulan, los iones salen de la trampa mediante un voltaje auxiliar
quadrupolo
-4 barras metalicas de seccion circular hiperbolica, rectas y paralelas
-por pares alternos se aplica un potencial constante v que origina un movimiento lat oscilante de los iones
-bajo ciertas condiones de potencial, determinado ion puede moverse sin chocar con las barras e ingresar al detector
-funciona como un verdadero filtro de masas
ms/ms
-esencialmente 2 espectrometros en tandem
deteccion de iones e interpretacion
-se detecta un flujo ionico, se amplific y se transmite a la computadora, donde se registra en forma de un espectro de masas
-en la interpretacion se pueden incluso determinar cofactores unidos, iones metalicos o modificaciones covalentes
la masa de los iones en el eje de las absisas y
la intesidad (abundancia) de los mismos en el eje de las ordenadas
el espectro de masa evidencia el numero de componentes en la muestra y
el peso molecular de cada componente
cristalografia de rayos x
-metodo para determinar la estructura tridimensional de una macromolecula (ej. proteina) mediante el analisis de difraccion de los rayos x por un compuesto cristalino
-determina la separacion de los atomos en una red cirstalina mediendo las ubicaciones de manchas producidas en una pelicula fotografica por un haz de rayos difractado
resolucion, de forma general
distancia minima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas
resolucion, de forma importante
depende de la longitud de onda de la luz
a menor onda de luz
mayor resolucion
un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede…
utilizarse para examinar detalles estructurales mas pequeños que su propia onda
distancia entre los puntos que resuelven
ojo humano
0.2mm
distancia entre los puntos que resuelven
microscopio optico
0.2 um
distancia entre los puntos que resuelven
microscopio electronico de barrido
2.5 um
distancia entre los puntos que resuelven
microscopio electronico de transmicion
1.0 um
los rayos x tienen longitudes de onda comparables a las
distancias atomico (0.1 nm)-moleculares (10nm (1x10-9)) a 10 picometros (1x10-12 metros).
se producen al someter una carga eletruca a una aceleracion (lanzar electrones sobre un metal)
los electrones de la macromolecula en estudio (proteina) emiten a su vez rayos X
-los electrones oscilan (se aceleran) conforme pasa la onda
-la emision en todas direcciones
las emisiones de varios electrones experimentan interferencia en diferentes direcciones
a. interferenciia constructiva
b. interferencia destructiva
a. interferenciia constructiva
en la pantalla aparece una mancha
b. interferencia destructiva
en la pantalla no hay señal
la amplitud de las ondas se incrementa cuando
se encuentran en fase
regiones brillantes
interferencias constructivas
regiones oscuras
interferencias destructivas
las distancias en las manchas son inversamente proporcional a
las distancias en la red real
