W3 HC.7 Proteomics, metabolomics, miRNA's en RNAi screens Flashcards
wat is proteomics?
- technologie waarmee we direct naar alle eiwitten van organismen kijken
- de hoeveelheid eiwit is een betere maat voor genexpressie dan mRNA
- nog niet zo snel en gemakkelijk, maar nieuwe verbeterde technieken maken dit wel mogelijk
- mogelijkheden voor analyse: eiwit-identificatie, -modificatie en -interactie mapping
hoe werkt eiwit identificatie met massa spectrometrie?
- eiwit of eiwitmengsel
- trypsine digestie
- analyse met massaspectrometrie
- data vergelijking (humane genoom project)
- identificatie van het eiwit
Uit welke stappen bestaat eiwit identificatie met massa spectrometrie?
- eiwit of eiwitmengsel wordt in korte stukjes geknipt d.m.v. trypsine digestie
- van de kleinere stukjes wordt de massa geïsoleerd d.m.v. massaspectometrie
- massa’s worden vergeleken met algemeen bekende massa’s van het menselijk proteoom
- match van gevonden eiwit
Waarom wordt bij de eerste stap er eerst voor gekozen om het eiwit in kleinere stukjes te knippen?
Hoe groter zo’n stuk van een eiwit is, hoe moeilijker het is om de massa van het eiwit te bepalen.
Dus je kan dit het beste doen voor stukjes peptiden van enkele aminozuren tot enkele 10tallen aminozuren.
Hoe komt het knippen tot kleinere stukjes tot stand?
Door het enzym trypsine, wat specifiek knipt op een plaats waar arginine (R) of lysine (K) zit (hij knipt daar vóór).
Hoe vindt massa analyse plaats van de stukjes peptide?
Eerst wordt ervoor gezorgd dat elk peptide een positieve lading krijgt (1+)
De positief geladen peptide wordt afgestoten door een positieve pol waarna het in de gas fase terecht komt.
Verderop staat een negatieve plaat waar de peptide door een gat in de plaat heen vliegt en in een vacuum buis komt.
De snelheid waarmee de peptide in de buis beweegt is afhankelijk van de massa.
Hoe kleiner de massa is, hoe sneller het peptide deeltje op de monitor terecht komt.
Dus kijkend naar de tijd wanneer het deeltje op de plaat terecht komt bepaald hoe groot de massa van het deeltje is.
Hoe komen we er dan uiteindelijk achter nadat we de massa van het deeltje hebben bepaald, welk eiwit het is?
Massa van het deeltje wordt vergeleken met info uit humane genoom database. Hier wordt geidentificeerd van welk eiwit het peptide stukje behoord.
Perks of studying proteomics, metabolomics, miRNA’s en RNAi screens?
Eigenlijk ben ik er even klaar mee!!!!
-> status na een half uur: even gefacetimet met di padre, vol moet gaat dit college afgemaakt worden
Wat is metabolomics?
Het analyseert welke metabolieten voorkomen, bijvoorbeeld in het bloed.
Zoals suikers, nucleotiden, aminozuren of vetten.
-> kan er een bepaalde samenstelling van metabolieten gevonden worden die typerend is voor iemand waarbij een tumor aanwezig is (dus een biomarker) met als idee zo vroeg mogelijk opsporen van eventueel vroegstadium tumor ontwikkeling
Waarom is mRNA geen goede marker voor de hoeveelheid eiwitten die gemaakt worden?
zitten nog veel stappen tussen waar nog van alles kan gebeuren.
- Er kan tijdens translatie meer of minder mRNA getransleerd worden
- Een eiwit kan ook afgebroken worden in de tussentijd
- De activiteit van een eiwit kan ook gereguleerd worden door de modificatie van eiwitten (zoals met phosphorylering)
wat is miRNA en wat doet het?
kleine stukjes RNA, welke de translatie van mRNA beinvloeden.
Het wordt ingebouwd in het RISC complex, welke uiteindelijk kan binden aan de 3’ kant van een mRNA molecuul. Als dat bindt, vermindert het de translatie van het mRNA.
-> Hoe meer miRNA, hoe minder translatie van mRNA.
Wat is trigger dubbelstrengsDNA?
Hetzelfde als miRNA; maar dan niet lichaamseigen. Het kan vanaf buiten het lichaam in gebracht worden en hetzelfde als miRNA tot stand brengen.
Wat doen RNAi’s (interferention), ook wel siRNA’s (short interferention) genoemd?
Zorgen voor mRNA afbraak.
Het kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen.
(wordt nog onderzocht)
In welke stappen vinden RNAi screens plaats om de achilleshiel van kankercellen te vinden?
- siRNA voor veel genen, elk in een aparte celkweek
- in elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld
- analyseer het effect van deze behandeling
- kijk welke siRNA’s celdood geven voor kankercellen, maar niet voor normale cellen
- controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezig zijn
- controleer of die remmer inderdaad werkt in cellen en diermodellen
take home message
- massa spectrometrie kan eiwitten identificeren en kwantificeren
- eiwitmodificaties (fosforylering, methylering, etc) kunnen worden geïdentificeerd
- micro-RNAs en siRNAs reguleren genexpressie
- siRNA kan gebruikt worden om genexpressie te verminderen en zo drug targets te vinden
- gegevens van genomics, proteomics, metabolomics en micro-RNA expressiepatronen worden gebruikt om inzicht in ziekteprocessen te verkrijgen; hiervoor is bioinformatica nodig
