W3 HC.3 Cytogenetische afwijkingen Flashcards
Hoe worden chromosomale afwijkingen geconstateerd?
Klassieke cytogenetica (banderingstechnieken)
Moleculaire cytogenetica
- Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
- Array (SNP array)
Moleculaire diagnostiek
- RQ-PCR (fusie genen)
- Q-PCR
- Sequencing (sanger -> next generation seq)
Voor cytogenetisch onderzoek is kweken nodig, chromosomen zijn pas zichtbaar als er celdeling plaatsvindt.
In welke stappen vind kweken plaats?
- beenmerg of bloed (met blasten) wordt in kweek gebracht met kweekmedium, waar evt. groeifactoren aan zijn toegevoegd: 1-2 dagen kweek
- aan de kweek wordt vervolgens colcemid = mitose blok toegevoegd om de celdeling stop te zetten: 1/2 uur
- de chromosomen zijn tijdens de metafase dus bevroren. Er wordt dan een hypotone oplossing toegevoegd, de cellen zwellen op en knappen vervolgens kapot.
- de kapotte cellen (met celkern en celdeling) worden gefixeerd en dan op een glaasje uitgespreid waarin de delingen (metastase) of celkernen (van cellen die op dat moment niet aan het delen waren) te zien zijn.
Wat voor typen chromosomale afwijkingen zijn er?
Numerieke afwijkingen
- winst (van een compleet chromosoom)
- verlies (van een compleet chromosoom)
Structurele afwijkingen
gebalanceerd:
- translocatie (uitwisseling terminaal segment)
- inversie (binnen een chromosoom: paracentisch/ pericentrisch)
- insertie
niet-gebalaceerd:
- deletie (terminaal/interstitieel)
- amplificatie (duplicatie, dmin, hsr)
- niet-gebalanceerde translocatie
- gen mutatie (op niveau van baseparen)
In 2008 is een nieuwe risicogroep ontdekt vwb karyotype: monosomaal karyotype. Wat houdt deze groep in?
- Twee monosomieën (geen X of Y) of
- Een monosomie en een structurele afwijking
zeer slecht risico (overall survival 5 jaar van 7%)
slechte overleving ondanks behandeling met allogene transplantatie
wat betekenen de afkortingen CBF, CN, MK-, MK+?
- CBF: core binding factor leukemias (t8;21), inv(16)
- CN: cytogenetisch normaal
- MK-: cytogenetisch afwijkend, geen MK
- MK+: monosomaal karyotype
(staat in volgorde van goede naar slechte survival)
Hoe werkt FISH (fluorescence in situ hybridization) in stappen?
- probe DNA wordt fluorescerend gelabeld.
- dan wordt probe gedenatureerd en gehybridiseerd of preparaat
- dan was je het preparaat
FISH wordt gebruikt op gekweekte en niet gekweekte cellen.
Metastase FISH: FISH op gekweekte (delende) cellen
- lymfocyten, leukocyten (beenmerk/bloed), solide tumoren
Interfase FISH: FISH op kernen van niet/slecht delende cellen
- snelle analyse
- beoordeling op basis van aantal signalen (eventueel fusie-signaal, of break-apart probes)
Wat zijn de voor- en nadelen van FISH?
Voordelen
- detectie van microdeleties
- breukpunt detectie en verbetering
- detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen
- snelle diagnostische detectie op interfase kernen
- demonstratie van een kleine hoeveelheid van afwijkende cellen
Nadelen
- gelimiteerde sensitiviteit
- geeft alleen antwoorden op de gestelde vragen: ‘je vindt alleen wat je zoekt’
- Beperkte target locaties om te onderzoeken
Hoe ontstaat co-lokalisatie bij FISH (vals positiviteit)?
Fusie-probes zijn ontworpen om translocaties aan te tonen. Wanneer geen sprake is van translocatie wordt twee keer rood en twee keer groen waargenomen.
-> Bij een translocatie verwisselen helften van bv. 18 en 14 en zo komen rood en groen naast elkaar te liggen. Dit fusiesignaal ziet er geel uit.
-> Wanneer het rode signaal boven het groene signaal ligt, wordt dit onterecht zichtbaar als een geel signaal: co-lokalisatie
Hoe werken break-apart probes?
De centromeer kant en de telomeer kant krijgen allebei een kleur (rood/groen)
- Bij break-apart probes gaan de stukken uit elkaar als er een breuk tussen komt. Als er geen translocatie is geweest, zijn er dus twee fusies zichtbaar (2x geel)
- In het geval dat er wel een translocatie heeft plaatsgevonden, wordt slechts één fusie en verder nog een rood en groen signaal waargenomen
(dus omgekeerd als bij fusie-probes)
Wat is het probleem in detectie van Multipel Myeloom?
- moeizaam chromosomen onderzoek
- laag percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat
- afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities
- resultaat: vaak een normaal karyotype, met afwijkende FISH op interfase kernen
- aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch)
Oplossing: hoger percentage plasmacellen nodig -> zuivering van plasmacellen
