Next generation sequencing Flashcards
waaruit bestaan DNA en humane genoom
DNA bestaat uit 46 chromosomen, 22 paar autosomen en 1 paar geslachtschromosomen
Humane genoom: 3 miljard DNA-basen, in elke diploïde cel dus 12 miljard DNA-bouwstenen
hoe werkt PCR
dubbelstrengs DNA–> temp hoog (>90^C)–> 2 losse strengen–> temp laag–> primers binden–> DNA-synthese polymerase verlengt–> 2e cyclus–> temp hoog–> primers–> synthese–> herhaal
o Als 30x herhaald–> 2x10^30 moleculen
o Door hoge temp gaat DNA-polymerase kapot–> elke keer na temperatuurverhoging nieuwe toevoegen maar hoeft niet door toevoeging van thermus aquaticus: deze bacs gaan pas kapot bij temp >120^C
doel NGS
tegelijk duizenden moleculen sequencen (massively parallel) uit opgebroken DNA
Tumorcellen hebben 1 normaal chromosoom en 1 met een mutatie
targeted NGS
Targeted NGS (amplicon enrichment): specifiek deel van het genoom gesequenced
Efficiënt maar continu maar 1 fragment uit een bepaald gebied wat gesequenced wordt
Hybridization enrichment
DNA wordt in kleine stukjes gesplitst en dan geamplificeerd, dan adapters toevoegen voor later sequencing: interessante gebieden gecaptured–> sequencen
Minder efficiënt maar kan wel meerdere fragmenten van bepaald gebied sequencen
wat is flowcell
Met adapters worden moleculen gebonden aan flowcell op afstand van elkaar
o Hierop worden de DNA-fragmenten geamplificeerd–> clusters van dezelfde moleculen
hoe werkt sequencing
Sequencing gebeurt tijdens synthese: elke nucleotide heeft eigen kleur die herkend wordt–> door fragmenten van de sequenties te vergelijken kan achterhaald worden van wel gen het afkomstig is
waarvoor is DNA barcoding
DNA barcoding is om sequenties van verschillende patiënten te vergelijken
Coverage (deep sequencing)
aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) is bepaald
o Hoe hoger de coverage hoe nauwkeuriger/ dieper gesequenced is
Whole genome sequencing (WGS)
deze is <100 maal diep
Targeted sequencing (TS):
100-1000 fragmenten gesequenced met coverage van minimal 500
Variant allel frequency (VAF)
aantal malen dat DNA-variant op een specifieke positie wordt gevonden t.o.v. het referentie DNA: dit is afhankelijk van het gen en het percentage tumorcellen
o 100% tumorweefsel in sample–>VAF 50%:
o 1 normaal en 1 mutant allel
o 50% tumor–> 25% VAF
conventionele sequencing (Sanger sequencing)
Mix van moleculen 1 fragment/ analyse Output max 1000 basen Veel DNA nodig Geringe hoeveelheid (20%) 1 sample (poolen niet mogelijk) Eenvoudige analyse
NGS
“Single molecule” Duizenden fragmenten/ analyse Output van 1-20 x 10^9 basen Weinig DNA nodig (20ng) Hoge gevoeligheid (1-2%) Poolen van samples (barcode) Bio-informatica nodig
toepassing NGS
kleine mutaties, deleties, amplificaties, translocaties en fusiegenen
o In praktijk: DD, therapiekeuze, clonaliteitsanalyse, oncogenetica en weefselindicatie
o Clonaliteitsanalyse: metastase of 2e primaire tumor
