Secuenciación del DNA Flashcards
El principio general de la secuenciación de DNA era:
obtener cuatro juegos de fragmentos marcados, cada uno correspondiente a cada una de las cuatro bases
En un principio se empleó marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia. V/F
Verdadero
La secuenciación de DNA fue posible en 1970 gracias a:
la introducción de los métodos electroforéticos y el conocimiento de la química de los nucleótidos y del metabolismo del DNA
Tipos de secuenciación de DNA:
- Método químico
- Métodos enzimáticos
- Siguiente generación
- Secuenciación por bisulfito
Método químico, consiste de 3 etapas fundamentales:
Método de Maxam y Gilbert
Etapas del Método de Maxam y Gilbert
- Marcaje del DNA
- Hidrólisis química especifica del DNA
- Análisis de los productos
El marcaje del DNA del método de Maxam y Gilbert consiste en:
marcar el extremo 5´de cada hebra, utilizando polinucleótido cinasa y ATP radiactivo.
Para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleótido conocido
Hidrólisis química especifica del DNA
En la hidrólisis química especifica del DNA la muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de:
eliminar separadamente las bases púricas (Gy A) y pirimidínicas (Cy T).
Agentes químicos utilizados en la hidrólisis química especifica del ADN
- Dimetil sultafo (G)
- Ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina (A, G)
- Hidrazina-piperidina (C, T)
- Hidrazina-1.5M NaCl-piperidina (C)
El análisis de los productos se realiza por electroforesis en el método de Maxam y Gilbert, V/F
Verdadero
Se basa en el mecanismo normal de la replicación del DNA. Se emplean ddNTPs y dNTPS
Método de Sanger
Carecen del grupo 3 hidroxilo necesario para que se lleve a cabo la polimerización.
ddNTPs
La polimerasa empleada en el método de Sanger deberá carecer de:
actividad 3-5’ exonucleasa de corrección.
M. Sanger
Los fragmentos de diferentes longitudes se generan por interrupción de la polimerización cada vez que un ddNTP se
incorpora a la cadena creciente. V/F
Verdadero
Métodos enzimáticos para la secuenciación de ADN:
- Sanger
- Automatizada
Secuenciación de DNA en Next-gen sequencing:
- 454-Pirosecuenciación
- Illumina
Variación del de Sanger-fluorescencia. Los ddNTPS están marcados con fluorescencia en lugar de radiactividad, la reacción se hace en un solo tubo.
Secuenciación automatizada
La separación de los fragmentos de DNA se logra por electroforesis capilar detectando diferencias en longitud de
un solo nucleótido.
Secuenciación automatizada
En la secuenciación automatizada, los fragmentos más cortos estarán hacia el 5’ y los más largos en la dirección 3’. V/F
Verdadero
Fluorocromos empleados en la secuenciación automatizada:
- A-JOE (verde)
- C-FA (azul)
- G-TAMRA (amarillo)
- T-ROX (rojo)
Gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis
Electroferograma
Compara la secuencia de una región específica en una persona portadora del polimorfismo/mutación que incluso puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutación asociado a la enfermedad
Detección de un polimorfismo o mutación puntual
Una reacción de secuenciación emplea un solo primer, lo que permite obtener la secuencia de una de las cadenas. En un análisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando el otro primer específico
Secuenciación de DNA
