Secuenciación del DNA Flashcards
El principio general de la secuenciación de DNA era:
obtener cuatro juegos de fragmentos marcados, cada uno correspondiente a cada una de las cuatro bases
En un principio se empleó marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia. V/F
Verdadero
La secuenciación de DNA fue posible en 1970 gracias a:
la introducción de los métodos electroforéticos y el conocimiento de la química de los nucleótidos y del metabolismo del DNA
Tipos de secuenciación de DNA:
- Método químico
- Métodos enzimáticos
- Siguiente generación
- Secuenciación por bisulfito
Método químico, consiste de 3 etapas fundamentales:
Método de Maxam y Gilbert
Etapas del Método de Maxam y Gilbert
- Marcaje del DNA
- Hidrólisis química especifica del DNA
- Análisis de los productos
El marcaje del DNA del método de Maxam y Gilbert consiste en:
marcar el extremo 5´de cada hebra, utilizando polinucleótido cinasa y ATP radiactivo.
Para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleótido conocido
Hidrólisis química especifica del DNA
En la hidrólisis química especifica del DNA la muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de:
eliminar separadamente las bases púricas (Gy A) y pirimidínicas (Cy T).
Agentes químicos utilizados en la hidrólisis química especifica del ADN
- Dimetil sultafo (G)
- Ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina (A, G)
- Hidrazina-piperidina (C, T)
- Hidrazina-1.5M NaCl-piperidina (C)
El análisis de los productos se realiza por electroforesis en el método de Maxam y Gilbert, V/F
Verdadero
Se basa en el mecanismo normal de la replicación del DNA. Se emplean ddNTPs y dNTPS
Método de Sanger
Carecen del grupo 3 hidroxilo necesario para que se lleve a cabo la polimerización.
ddNTPs
La polimerasa empleada en el método de Sanger deberá carecer de:
actividad 3-5’ exonucleasa de corrección.
M. Sanger
Los fragmentos de diferentes longitudes se generan por interrupción de la polimerización cada vez que un ddNTP se
incorpora a la cadena creciente. V/F
Verdadero
Métodos enzimáticos para la secuenciación de ADN:
- Sanger
- Automatizada
Secuenciación de DNA en Next-gen sequencing:
- 454-Pirosecuenciación
- Illumina
Variación del de Sanger-fluorescencia. Los ddNTPS están marcados con fluorescencia en lugar de radiactividad, la reacción se hace en un solo tubo.
Secuenciación automatizada
La separación de los fragmentos de DNA se logra por electroforesis capilar detectando diferencias en longitud de
un solo nucleótido.
Secuenciación automatizada
En la secuenciación automatizada, los fragmentos más cortos estarán hacia el 5’ y los más largos en la dirección 3’. V/F
Verdadero
Fluorocromos empleados en la secuenciación automatizada:
- A-JOE (verde)
- C-FA (azul)
- G-TAMRA (amarillo)
- T-ROX (rojo)
Gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis
Electroferograma
Compara la secuencia de una región específica en una persona portadora del polimorfismo/mutación que incluso puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutación asociado a la enfermedad
Detección de un polimorfismo o mutación puntual
Una reacción de secuenciación emplea un solo primer, lo que permite obtener la secuencia de una de las cadenas. En un análisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando el otro primer específico
Secuenciación de DNA
Permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en unas horas.
454-Pirosecuenciación
Método de secuenciación de ADN en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs
454-Pirosecuenciación
En la 454-Pirosecuenciación, no se requiere:
correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs.
454-Pirosecuenciación
El genoma de fragmenta en cadenas de algunos cientos de pares de bases (300-800pb) V/F
Verdadero
454-Pirosecuenciación
Se ligan oligonucleótidos sintéticos A y B los extremos:
- A. Para que la secuencia se una a una microesfera (micro reactor).
- B. Para la amplificación (PCR en emulsión) y secuenciación. Permiten la hibridación de un primer/cebador universal.
Cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de aceite y separada de las demás esferas.
PCR en emulsión
Al final de la PCR en emulsión, ¿cuántos fragmentos de DNA idénticos quedan dentro en cada microesfera?
aprox. 2 millones
Las microesferas se depositan en una microcelda con 200,000 pocillos de 44 µm. Una sola esfera por pozo
Preparación de la micromatriz
En la preparación de la micromatriz, los pocillos se rellenan con esferas más pequeñas en las que se han inmovilizado enzimas para la secuenciación. V/F
Verdadero
Enzimas necesarias para la Pirosecuenciación
- DNA polimerasa
- Sulfurilasa y su sustrato (Adenosina 5- fosfosulfato)
- Luciferasa y su sustrato (luciferina)
- Apirasa
Pirosecuenciación
Incorpora dNTPs liberando PPi
DNA polimerasa
Síntesis de ATP dependiente de PPi
Sulfurilasa y su sustrato (APS)
Emisión de luz dependiente de ATP
Luciferasa y su sustrato (luciferina)
Degradación de dNTPs no incorporados
Apirasa
Pirosecuenciación
Cada vez que en uno de los pocillos se incorpora un nucleótido se genera una señal quimioluminiscente que es
recogida por una cámara digital. V/F
Verdadero
Hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleótidos a través de la placa que contiene los pocillos.
Sistema de flujo de la pirosecuenciación
Se analizan las imágenes obtenidas y se determina la secuencia del fragmento.
Se reconstruye la secuencia del genoma original por métodos computacionales.
Pirosecuenciación
Nucleótidos terminadores marcados, bloqueados reversiblemente en el 3’OH
Illumina. Terminador reversible
Illumina
El bloqueo se retira química o fotolíticamente después de:
la polimerización y que se haya registrado la señal fluorescente
Permite detectar con alta sensibilidad patrones de metilación aberrantes (cambios epigenéticos - DNA).
Secuenciación por bisulfito
El tratamiento con bisulfito se hace previo a la secuenciación. V/F
Verdadero
El tratamiento con bisulfito convierte al
uracilo en citosina y afecta a la 5-metilcitosina. V/F
Falso, convierte a la citosina en uracilo, pero no afecta a la 5-metilcitosina.
La secuenciación por bisulfito da falsos positivos en…
el RNA y muestras con conversión incompleta
La secuenciación por bisulfito es útil en:
Análisis de muestras forenses, células madre, enfermedades como cáncer
