Secuenciación del DNA

Question 1

El principio general de la secuenciación de DNA era:

Answer 1

obtener cuatro juegos de fragmentos marcados, cada uno correspondiente a cada una de las cuatro bases

Question 2

En un principio se empleó marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia. V/F

Answer 2

Verdadero

Question 3

La secuenciación de DNA fue posible en 1970 gracias a:

Answer 3

la introducción de los métodos electroforéticos y el conocimiento de la química de los nucleótidos y del metabolismo del DNA

Question 4

Tipos de secuenciación de DNA:

Answer 4

• Método químico
• Métodos enzimáticos
• Siguiente generación
• Secuenciación por bisulfito

Question 5

Método químico, consiste de 3 etapas fundamentales:

Answer 5

Método de Maxam y Gilbert

Question 6

Etapas del Método de Maxam y Gilbert

Answer 6

1. Marcaje del DNA
2. Hidrólisis química especifica del DNA
3. Análisis de los productos

Question 7

El marcaje del DNA del método de Maxam y Gilbert consiste en:

Answer 7

marcar el extremo 5´de cada hebra, utilizando polinucleótido cinasa y ATP radiactivo.

Question 8

Para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleótido conocido

Answer 8

Hidrólisis química especifica del DNA

Question 9

En la hidrólisis química especifica del DNA la muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de:

Answer 9

eliminar separadamente las bases púricas (Gy A) y pirimidínicas (Cy T).

Question 10

Agentes químicos utilizados en la hidrólisis química especifica del ADN

Answer 10

• Dimetil sultafo (G)
• Ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina (A, G)
• Hidrazina-piperidina (C, T)
• Hidrazina-1.5M NaCl-piperidina (C)

Question 11

El análisis de los productos se realiza por electroforesis en el método de Maxam y Gilbert, V/F

Answer 11

Verdadero

Question 12

Se basa en el mecanismo normal de la replicación del DNA. Se emplean ddNTPs y dNTPS

Answer 12

Método de Sanger

Question 13

Carecen del grupo 3 hidroxilo necesario para que se lleve a cabo la polimerización.

Answer 13

ddNTPs

Question 14

La polimerasa empleada en el método de Sanger deberá carecer de:

Answer 14

actividad 3-5’ exonucleasa de corrección.

Question 15

M. Sanger
Los fragmentos de diferentes longitudes se generan por interrupción de la polimerización cada vez que un ddNTP se
incorpora a la cadena creciente. V/F

Answer 15

Verdadero

Question 16

Métodos enzimáticos para la secuenciación de ADN:

Answer 16

• Sanger
• Automatizada

Question 17

Secuenciación de DNA en Next-gen sequencing:

Answer 17

• 454-Pirosecuenciación
• Illumina

Question 18

Variación del de Sanger-fluorescencia. Los ddNTPS están marcados con fluorescencia en lugar de radiactividad, la reacción se hace en un solo tubo.

Answer 18

Secuenciación automatizada

Question 19

La separación de los fragmentos de DNA se logra por electroforesis capilar detectando diferencias en longitud de
un solo nucleótido.

Answer 19

Secuenciación automatizada

Question 20

En la secuenciación automatizada, los fragmentos más cortos estarán hacia el 5’ y los más largos en la dirección 3’. V/F

Answer 20

Verdadero

Question 21

Fluorocromos empleados en la secuenciación automatizada:

Answer 21

• A-JOE (verde)
• C-FA (azul)
• G-TAMRA (amarillo)
• T-ROX (rojo)

Question 22

Gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis

Answer 22

Electroferograma

Question 23

Compara la secuencia de una región específica en una persona portadora del polimorfismo/mutación que incluso puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutación asociado a la enfermedad

Answer 23

Detección de un polimorfismo o mutación puntual

Question 24

Una reacción de secuenciación emplea un solo primer, lo que permite obtener la secuencia de una de las cadenas. En un análisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando el otro primer específico

Answer 24

Secuenciación de DNA

Question 25

Permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en unas horas.

Answer 25

454-Pirosecuenciación

Question 26

Método de secuenciación de ADN en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs

Answer 26

454-Pirosecuenciación

Question 27

En la 454-Pirosecuenciación, no se requiere:

Answer 27

correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs.

Question 28

454-Pirosecuenciación
El genoma de fragmenta en cadenas de algunos cientos de pares de bases (300-800pb) V/F

Answer 28

Verdadero

Question 29

454-Pirosecuenciación
Se ligan oligonucleótidos sintéticos A y B los extremos:

Answer 29

• A. Para que la secuencia se una a una microesfera (micro reactor).
• B. Para la amplificación (PCR en emulsión) y secuenciación. Permiten la hibridación de un primer/cebador universal.

Question 30

Cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de aceite y separada de las demás esferas.

Answer 30

PCR en emulsión

Question 31

Al final de la PCR en emulsión, ¿cuántos fragmentos de DNA idénticos quedan dentro en cada microesfera?

Answer 31

aprox. 2 millones

Question 32

Las microesferas se depositan en una microcelda con 200,000 pocillos de 44 µm. Una sola esfera por pozo

Answer 32

Preparación de la micromatriz

Question 33

En la preparación de la micromatriz, los pocillos se rellenan con esferas más pequeñas en las que se han inmovilizado enzimas para la secuenciación. V/F

Answer 33

Verdadero

Question 34

Enzimas necesarias para la Pirosecuenciación

Answer 34

• DNA polimerasa
• Sulfurilasa y su sustrato (Adenosina 5- fosfosulfato)
• Luciferasa y su sustrato (luciferina)
• Apirasa

Question 35

Pirosecuenciación
Incorpora dNTPs liberando PPi

Answer 35

DNA polimerasa

Question 36

Síntesis de ATP dependiente de PPi

Answer 36

Sulfurilasa y su sustrato (APS)

Question 37

Emisión de luz dependiente de ATP

Answer 37

Luciferasa y su sustrato (luciferina)

Question 38

Degradación de dNTPs no incorporados

Answer 38

Apirasa

Question 39

Pirosecuenciación
Cada vez que en uno de los pocillos se incorpora un nucleótido se genera una señal quimioluminiscente que es
recogida por una cámara digital. V/F

Answer 39

Verdadero

Question 40

Hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleótidos a través de la placa que contiene los pocillos.

Answer 40

Sistema de flujo de la pirosecuenciación

Question 41

Se analizan las imágenes obtenidas y se determina la secuencia del fragmento.
Se reconstruye la secuencia del genoma original por métodos computacionales.

Answer 41

Pirosecuenciación

Question 42

Nucleótidos terminadores marcados, bloqueados reversiblemente en el 3’OH

Answer 42

Illumina. Terminador reversible

Question 43

Illumina
El bloqueo se retira química o fotolíticamente después de:

Answer 43

la polimerización y que se haya registrado la señal fluorescente

Question 44

Permite detectar con alta sensibilidad patrones de metilación aberrantes (cambios epigenéticos - DNA).

Answer 44

Secuenciación por bisulfito

Question 45

El tratamiento con bisulfito se hace previo a la secuenciación. V/F

Answer 45

Verdadero

Question 46

El tratamiento con bisulfito convierte al
uracilo en citosina y afecta a la 5-metilcitosina. V/F

Answer 46

Falso, convierte a la citosina en uracilo, pero no afecta a la 5-metilcitosina.

Question 47

La secuenciación por bisulfito da falsos positivos en…

Answer 47

el RNA y muestras con conversión incompleta

Question 48

La secuenciación por bisulfito es útil en:

Answer 48

Análisis de muestras forenses, células madre, enfermedades como cáncer