PCR y sus variantes Flashcards
Premio Nobel de Química 1993
Kary Mullis
Puede amplificar selectivamente una secuencia deseada de ADN de copia unica que se encuentre presente en una
mezcla compleja de moléculas de ADN
PCR
¿La PCR necesita purificación previa de la secuencia de interés?
Falso
Logran que solo se amplifique una zona del ADN en la PCR.
Primers o cebadores
Sintetiza la hebra complementaria incorporando los dNTPs libres (A, T, G, C) del medio de reacción, inicialmente dirigida por los primers o cebadores
ADN polimerasa termoestable
¿Cómo son los ciclos de la PCR?
Ciclos controlados de temperaturas de desnaturalización, alineamiento y elongación
Componentes de la mezcla de reacción para PCR:
- DNA
- Primers o cebadores (oligonucleótidos).
- Tag Polimerasa
- dNTPs (A, T, G, C)
En los ciclos de PCR se aumenta la temperatura para:
romper los puentes de hidrógeno
Temperatura de desnaturalización
94 a 95 °C
Temperaturas que evitan la renaturalización del DNA
≥ 90 °C
Oligonucleótidos específicos (20-23 nt) cuya secuencia es complementaria a los extremos del fragmento (zona del DNA)
que se desea amplificar.
Primers
Al disminuir la temperatura los primers hibridan específicamente en los extremos de la secuencia blanco. Un primer en cada hebra. V/F
Verdadero
¿Los primers dirigen a la ADN polimerasa?
Verdadero
¿Cuántas moléculas de DNA se obtienen después del 1er ciclo?
2 moléculas de ADN doble cadena parcial
que contienen la secuencia blanco.
¿Por qué solo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado?
porque la polimerasa solo puede copiar moléculas que tienen el cebador unido
Después de 30 ciclos hay más de 1x10 moléculas del producto especifico y solamente 60 moléculas parcialmente doble cadena más largas. V/F
Verdadero
Tiene la capacidad de mantener cambios de temperatura cíclicos de forma precisa
Termociclador
Fases de una PCR:
- Exponencial
- Linear
- Plateau
Un mayor número de copias del DNA molde dan una banda más intensa
del amplificado. V/F
Verdadero
Mayor número de copias del DNA molde dan una banda más intensa del amplificado, ¿es cierto hasta qué?
cantidades excesivas de DNA molde inhiben la reacción
Fase de la PCR que detecta PCR tiempo real
Exponencial
Fase de PCR que detecta PCR convencional:
Plateau
A mayor número de ciclos, mayor…
cantidad del producto de PCR (amplificado)
A mayor número de ciclos, mayor cantidad del producto de PCR, hasta que…
los componentes de la reacción se agotan
La amplificación se detiene
Fase plateau de la PCR
Variantes de la PCR:
- Con adaptadores
- Inversa
- Mutagénesis dirigida
- RT-PCR
- qPCR
- RT-qPCR
- Múltiplex
Amplifica una región de ADN de secuencia desconocida, uniendo adaptadores a los fragmentos de restricción de extremos cohesivos.
PCR con adaptadores
PCR con adaptadores
Se añaden primers específicos para las secuencias de los adaptadores. V/F
Verdadero
Permite amplificar secuencias desconocidas con la condición de que se encuentran al lado de una secuencia conocida de ADN
PCR inversa
Se refiere a una amplia variedad de técnicas in vitro que modifican la secuencia silvestre.
Mutagénesis dirigida
Cuando no hay sitios de restricción localizados en el lugar deseado, se puede emplear:
un enfoque de PCR
En la mutagénesis dirigida se pueden cambiar de una a tres bases en un segmento de DNA determinado sintetizando primers de PCR que lleven
estos cambios. V/F
Verdadero
Emplea dos enzimas polimerasas
RT-PCR
Realiza la síntesis de cDNA a partir del mRNA.
DNA polimerasa RNA dependiente (retrotranscriptasa)
RT-PCR
Los clones de cDNA contienen:
secuencias codificantes que son discontinuas (mayoría de genes eucariotas)
El cDNA sintetizado por la retrotranscriptasa se amplifica
por PCR gracias a la enzima:
DNA polimerasa DNA dependiente
Amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el producto específico de la amplificación.
PCR tiempo real
Con que otro nombre se le conoce a la PCR tiempo real
PCR cuantitativa
Adicionado a la mezcla de reacción de la qPCR y emite fluorescencia
fluoróforo
El fluoróforo emite fluorescencia en función de:
la abundancia del producto de amplificación.
Se le denomina PCR tiempo real porqué..
La medición de la fluorescencia se realiza luego de cada ciclo de amplificación
Número de ciclos requeridos para que la fluorescencia específica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecífica.
Ciclo umbral, cycle threshold (Ct)
¿El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN blanco inicial?
Verdadero
PCR tiempo real los utiliza para fluorescencia:
- SYBR Green
- Sondas TaqMan
El complejo ADN-SYBR Green presenta
el pico de absorción en:
498 nm
El complejo ADN-SYBR Green presenta
el pico de emisión en:
522 nm (zona verde)
SYBR green no es un agente intercalante porque…
se asocia a la molécula de DNA interactuando con la hendidura menor
El principio de la sonda TaqMan se basa en:
la actividad 5-3’ exonucleasa de la polimerasa
Las Sondas TaqMan aumentan significativamente la especificidad de la detección. V/F
Verdadero
La fluorescencia resultante de la
acumulación del producto se mide durante:
la fase exponencial de la PCR
Después de obtener cDNA a partir del mRNA en la 1ra reacción de retrotranscripción, el cDNA se amplifica por qPCR
RT-qPCR
En la RT-qPCR los niveles de expresión de un gen en particular se normalizan con respecto al nivel de expresión de un gen constitutivo para poder hacer la comparación entre muestras, tratamientos y/o condiciones de la célula. V/F
Verdadero
Amplifica más de una secuencia en una misma reacción, empleando dos o más pares de primers en un único tubo.
PCR múltiplex
PCR múltiplex se utiliza para:
- Diagnóstico de enfermedades causadas por diferentes agentes
- Determinar variantes de un mismo virus
