Extracción y cuantificación de proteínas Flashcards
¿Para qué nos sirve extraer proteínas?
- Purificación
- Secuenciación
- Expresión de una proteína recombinante
- Inmunoensayos
- Análisis estructurales
- Estudiar su función y regulación
- Estudiar sus interacciones con otras moléculas
Pasos para la extracción de proteínas:
- Disrupción mecánica
- Lisis celular
- Separación de las membranas y restos celulares
- Precipitación de proteínas solubles
- Centrifugación
- Resuspensión de proteínas
La disrupción mecánica se lleva a cabo en:
Tejidos principalmente, no es necesaria si la muestra proviene de cultivo celular.
Disrupciones mecánicas de muestras:
- Licuadora
- Homogeneizador Dounce
- Homogeneizador de ultrasonido
- Pulverización en Nitrógeno líquido
- Perlas de vidrio
La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias
Licuadora
En el método de licuadora, ¿qué tipo de muestra se utiliza?
Gran cantidad de tejido
Tubo de vidrio con pistón ajustado, maja las células por acción de corte:
Homogeneizador Dounce
Tipo de muestra para el homogeneizador Dounce
Células tisulares, útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares
Tipo de muestras utilizadas en el homogeneizador de ultrasonidos:
Células, tejidos, bacterias
Ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celulares
Homogeneizador de ultrasonidos
La muestra se pulveriza utilizando un mortero y un almirez refrigerados
Pulverización en Nitrógeno líquido
Tipos de muestras utilizadas para la pulverización en Nitrógeno líquido
Tejido animal o vegetal
La ruptura de la célula se produce por agitación de las perlas de vidrio
Perlas de vidrio
Tipo de muestra para el método de perlas de vidrio
Levaduras
El buffer de lisis contiene:
- Inhibidores de proteasas
- Detergente
- Algunos agentes estabilizadores
Qué contiene el detergente para lisis celular?
- SDS, desnaturalizante
- Tritón X-100 no desnaturalizante
Reduce el daño por oxidación, quela iones metálicos:
EDTA 10 mM
Estabiliza las membranas lisosómicas, reduce la liberación de proteasas
Sacarosa o glucosa 25 mM
- Reduce la pérdida debida a la asociación con componentes celulares o a la autoagregación.
- Extracción y purificación de las proteinas integrales de membrana.
- Solubilización de proteínas poco solubles
Detergentes, 0.01% - 1%
Para estabilización, se puede utilizar hasta un 50% si es necesario
Glicerol 5% - 10%
Para estabilización
Sacarosa al 10%
Degradación de ácidos nucleicos, reduce la viscosidad de la solución
Nucleasas (DNAasa y RNAasa)
Coctel de diferentes inhibidores cada uno con especificidad para diferentes proteasas en particular, evitando la degradación global de las proteínas en el extracto.
Inhibidores de proteasas
Inhibidores de proteasas:
- Aprotinina
- EDTA
- EGTA
- Leupeptin
- Pepstatina A
- PMSF
EDTA.
Ácido etilendiaminotetraacético
EGTA
Ácido etilenglicol tetraacético
PMSF
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
Enzima diana de la aprotinina
Proteasas de Serina
Enzima diana del EDTA
Mg/Mn Metaloproteasas
Enzima diana del EGTA
Ca+ Metaloproteasas
Enzimas diana del Leupeptin
Proteasas de Serinas, Cisteinas
Enzima diana de la Pepstatina A
Proteasas de Aspártico
Enzimas diana del PMSF
Proteasas de Serina
Al centrifugar, en el sobrenadante se encuentran:
todas las proteínas solubles de la célula
Al centrifugar, en el pellet se encuentran:
las membranas y proteínas hidrofóbicas de membrana
Las membranas y proteínas hidrofóbicas de membrana pueden ser de interés, V/F
Verdadero
Para precipitar las proteínas solubles del sobrenadante se utiliza:
- Sulfato de amonio (NH4)2SO4 No desnaturalizante
- Etanol y acetona
Es el más ampliamente utilizado para la cuantificación de proteínas
Ensayo de Bradford
El ensayo de Bradford se basa en:
el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida
El colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida, conforme reacciona con las proteínas se torna:
Café-rojizo
En el ensayo de Bradford se realiza una curva patrón con concentraciones desconocidas, V/F
Falso, la curva patrón se realiza con concentraciones conocidas
La curva patrón se lee a cuántos nanómetros y a qué sensibilidad?
a 595nm y a una sensibilidad de 1 μg/ ml.
