Extracción y cuantificación de proteínas

Question 1

¿Para qué nos sirve extraer proteínas?

Answer 1

• Purificación
• Secuenciación
• Expresión de una proteína recombinante
• Inmunoensayos
• Análisis estructurales
• Estudiar su función y regulación
• Estudiar sus interacciones con otras moléculas

Question 2

Pasos para la extracción de proteínas:

Answer 2

• Disrupción mecánica
• Lisis celular
• Separación de las membranas y restos celulares
• Precipitación de proteínas solubles
• Centrifugación
• Resuspensión de proteínas

Question 3

La disrupción mecánica se lleva a cabo en:

Answer 3

Tejidos principalmente, no es necesaria si la muestra proviene de cultivo celular.

Question 4

Disrupciones mecánicas de muestras:

Answer 4

• Licuadora
• Homogeneizador Dounce
• Homogeneizador de ultrasonido
• Pulverización en Nitrógeno líquido
• Perlas de vidrio

Question 5

La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias

Answer 5

Licuadora

Question 6

En el método de licuadora, ¿qué tipo de muestra se utiliza?

Answer 6

Gran cantidad de tejido

Question 7

Tubo de vidrio con pistón ajustado, maja las células por acción de corte:

Answer 7

Homogeneizador Dounce

Question 8

Tipo de muestra para el homogeneizador Dounce

Answer 8

Células tisulares, útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares

Question 9

Tipo de muestras utilizadas en el homogeneizador de ultrasonidos:

Answer 9

Células, tejidos, bacterias

Question 10

Ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celulares

Answer 10

Homogeneizador de ultrasonidos

Question 11

La muestra se pulveriza utilizando un mortero y un almirez refrigerados

Answer 11

Pulverización en Nitrógeno líquido

Question 12

Tipos de muestras utilizadas para la pulverización en Nitrógeno líquido

Answer 12

Tejido animal o vegetal

Question 13

La ruptura de la célula se produce por agitación de las perlas de vidrio

Answer 13

Perlas de vidrio

Question 14

Tipo de muestra para el método de perlas de vidrio

Answer 14

Levaduras

Question 15

El buffer de lisis contiene:

Answer 15

• Inhibidores de proteasas
• Detergente
• Algunos agentes estabilizadores

Question 16

Qué contiene el detergente para lisis celular?

Answer 16

• SDS, desnaturalizante
• Tritón X-100 no desnaturalizante

Question 17

Reduce el daño por oxidación, quela iones metálicos:

Answer 17

EDTA 10 mM

Question 18

Estabiliza las membranas lisosómicas, reduce la liberación de proteasas

Answer 18

Sacarosa o glucosa 25 mM

Question 19

• Reduce la pérdida debida a la asociación con componentes celulares o a la autoagregación.
• Extracción y purificación de las proteinas integrales de membrana.
• Solubilización de proteínas poco solubles

Answer 19

Detergentes, 0.01% - 1%

Question 20

Para estabilización, se puede utilizar hasta un 50% si es necesario

Answer 20

Glicerol 5% - 10%

Question 21

Para estabilización

Answer 21

Sacarosa al 10%

Question 22

Degradación de ácidos nucleicos, reduce la viscosidad de la solución

Answer 22

Nucleasas (DNAasa y RNAasa)

Question 23

Coctel de diferentes inhibidores cada uno con especificidad para diferentes proteasas en particular, evitando la degradación global de las proteínas en el extracto.

Answer 23

Inhibidores de proteasas

Question 24

Inhibidores de proteasas:

Answer 24

• Aprotinina
• EDTA
• EGTA
• Leupeptin
• Pepstatina A
• PMSF

Question 25

EDTA.

Answer 25

Ácido etilendiaminotetraacético

Question 26

EGTA

Answer 26

Ácido etilenglicol tetraacético

Question 27

PMSF

Answer 27

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

Question 28

Enzima diana de la aprotinina

Answer 28

Proteasas de Serina

Question 29

Enzima diana del EDTA

Answer 29

Mg/Mn Metaloproteasas

Question 30

Enzima diana del EGTA

Answer 30

Ca+ Metaloproteasas

Question 31

Enzimas diana del Leupeptin

Answer 31

Proteasas de Serinas, Cisteinas

Question 32

Enzima diana de la Pepstatina A

Answer 32

Proteasas de Aspártico

Question 33

Enzimas diana del PMSF

Answer 33

Proteasas de Serina

Question 34

Al centrifugar, en el sobrenadante se encuentran:

Answer 34

todas las proteínas solubles de la célula

Question 35

Al centrifugar, en el pellet se encuentran:

Answer 35

las membranas y proteínas hidrofóbicas de membrana

Question 36

Las membranas y proteínas hidrofóbicas de membrana pueden ser de interés, V/F

Answer 36

Verdadero

Question 37

Para precipitar las proteínas solubles del sobrenadante se utiliza:

Answer 37

• Sulfato de amonio (NH4)2SO4 No desnaturalizante
• Etanol y acetona

Question 38

Es el más ampliamente utilizado para la cuantificación de proteínas

Answer 38

Ensayo de Bradford

Question 39

El ensayo de Bradford se basa en:

Answer 39

el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida

Question 40

El colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida, conforme reacciona con las proteínas se torna:

Answer 40

Café-rojizo

Question 41

En el ensayo de Bradford se realiza una curva patrón con concentraciones desconocidas, V/F

Answer 41

Falso, la curva patrón se realiza con concentraciones conocidas

Question 42

La curva patrón se lee a cuántos nanómetros y a qué sensibilidad?

Answer 42

a 595nm y a una sensibilidad de 1 μg/ ml.