Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
Extracción de:
- DNA
- RNA
Para cuantificar y determinar la pureza:
Espectrofotómetro
Para purificación:
- Cromatografía de afinidad
- Electroforesis
La electroforesis convencional en gel se usa para:
análisis cualitativo y cuantitativo
Tipos de electroforesis en la purificación:
- Convencional
- Campo pulsado
- Capilar
Es el primer paso en la tecnología del DNA recombinante:
Aislamiento del DNA
La extracción de DNA sirve para:
- Amplificación
- Secuenciación
- Determinar polimorfismos
- Diagnóstico de enfermedades
- Transferencia génica
- Obtención de proteínas recombinantes
- Terapia génica
¿Dónde se encuentra el DNA genómico de las células eucariotas?
en el núcleo
El DNA mitocondrial de la célula eucariota se encuentra en:
la mitocondria
Son compartimentos delimitados y rodeados por membranas:
El núcleo y la mitocondria
¿En las células eucariotas encontramos DNA plasmídico?
No, solo se encuentra en las procariotas
Pasos para la extracción de DNA genómico:
- Muestra de células
- Lisis celular
- Precipitación de proteínas
- Precipitación del DNA
- Lavados
- Resuspensión
- Cuantificación y determinación de pureza
Ejemplo de muestras de células para la extracción de DNA:
- Cabello
- Piel
- Mucosa bucal
- Sangre
El buffer de lisis contiene:
- 50 mM Tris-HCL, pH 8
- 1% SDS
- Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)
Buffer que mantiene el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa
50 mM Tris-HCL, pH 8
Detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA:
Dodecyl Sulfato de Sodio (SDS 1%)
El SDS renaturaliza las proteínas dejándolas inaccesibles para las proteasas. V/F
Falso, las desnaturaliza y las deja accesibles
Cuando el SDS entra en contacto con la célula captura los lípidos y las proteínas, mientras que el ácido nucleico permanece en solución. V/F
Verdadero
Aislada del hongo Tritirachium album
Proteinasa K
La proteinasa K es una serina proteasa que se activa…
bajo condiciones desnaturalizantes
La proteinasa K es capaz de inactivar las:
RNAsas y DNAsas
La proteinasa K incrementa:
- La pureza del DNA, menor contaminación por proteínas
- La calidad/cantidad de DNA no degradado
Las proteínas se insolubilizan y precipitan, por ejemplo, con soluciones de acetona:
Precipitación de proteínas
Si la muestra se centrifuga, en el pellet queda:
las proteínas y restos celulares
Si la muestra se centrifuga, en el sobrenadante se encuentra:
el ácido nucleico
En la precipitación del DNA se utiliza:
una alta concentración de sales (NaCl)
Los iones de Na+ neutralizan las cargas positivas de los grupos fosfato. V/F
Falso, los grupos fosfato poseen cargas negativas
Una alta concentración de sales en la precipitación del DNA hace que:
- las moléculas del DNA se junten en lugar de repelerse
- disminuya la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso
La precipitación del DNA se facilita al añadir:
alcohol
El etanol es una molécula menos polar que el agua y es miscible en ella. V/F
Verdadero
El DNA no es soluble en etanol por lo que:
el DNA precipita
El RNA es más polar que el DNA, por lo tanto:
el RNA no precipita
¿Qué se debe hacer para insolubilizar aún más el DNA?
Disminuir la temperatura (incubación en hielo)
Después de la centrifugación en frío del DNA insolubilizado se obtiene:
una pastilla (pellet) blanca compacta en el fondo del tubo
Los lavados se realizan un par de veces con:
soluciones de etanol al 75%
El DNA se solubiliza en agua libre de nucleasas
Resuspensión del DNA
Nivel máximo de los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteínas
- AN → 260 nm
- P → 280 nm
El espectrofotómetro calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución en base a:
la absorbancia a 260 nm
La pureza se determina mediante el coeficiente…
260/280
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.8 - 2, la pureza del DNA es…
Óptima
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.6 - 1.8, la pureza del DNA es…
Aceptable
