Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
Extracción de:
- DNA
- RNA
Para cuantificar y determinar la pureza:
Espectrofotómetro
Para purificación:
- Cromatografía de afinidad
- Electroforesis
La electroforesis convencional en gel se usa para:
análisis cualitativo y cuantitativo
Tipos de electroforesis en la purificación:
- Convencional
- Campo pulsado
- Capilar
Es el primer paso en la tecnología del DNA recombinante:
Aislamiento del DNA
La extracción de DNA sirve para:
- Amplificación
- Secuenciación
- Determinar polimorfismos
- Diagnóstico de enfermedades
- Transferencia génica
- Obtención de proteínas recombinantes
- Terapia génica
¿Dónde se encuentra el DNA genómico de las células eucariotas?
en el núcleo
El DNA mitocondrial de la célula eucariota se encuentra en:
la mitocondria
Son compartimentos delimitados y rodeados por membranas:
El núcleo y la mitocondria
¿En las células eucariotas encontramos DNA plasmídico?
No, solo se encuentra en las procariotas
Pasos para la extracción de DNA genómico:
- Muestra de células
- Lisis celular
- Precipitación de proteínas
- Precipitación del DNA
- Lavados
- Resuspensión
- Cuantificación y determinación de pureza
Ejemplo de muestras de células para la extracción de DNA:
- Cabello
- Piel
- Mucosa bucal
- Sangre
El buffer de lisis contiene:
- 50 mM Tris-HCL, pH 8
- 1% SDS
- Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)
Buffer que mantiene el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa
50 mM Tris-HCL, pH 8
Detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA:
Dodecyl Sulfato de Sodio (SDS 1%)
El SDS renaturaliza las proteínas dejándolas inaccesibles para las proteasas. V/F
Falso, las desnaturaliza y las deja accesibles
Cuando el SDS entra en contacto con la célula captura los lípidos y las proteínas, mientras que el ácido nucleico permanece en solución. V/F
Verdadero
Aislada del hongo Tritirachium album
Proteinasa K
La proteinasa K es una serina proteasa que se activa…
bajo condiciones desnaturalizantes
La proteinasa K es capaz de inactivar las:
RNAsas y DNAsas
La proteinasa K incrementa:
- La pureza del DNA, menor contaminación por proteínas
- La calidad/cantidad de DNA no degradado
Las proteínas se insolubilizan y precipitan, por ejemplo, con soluciones de acetona:
Precipitación de proteínas
Si la muestra se centrifuga, en el pellet queda:
las proteínas y restos celulares
Si la muestra se centrifuga, en el sobrenadante se encuentra:
el ácido nucleico
En la precipitación del DNA se utiliza:
una alta concentración de sales (NaCl)
Los iones de Na+ neutralizan las cargas positivas de los grupos fosfato. V/F
Falso, los grupos fosfato poseen cargas negativas
Una alta concentración de sales en la precipitación del DNA hace que:
- las moléculas del DNA se junten en lugar de repelerse
- disminuya la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso
La precipitación del DNA se facilita al añadir:
alcohol
El etanol es una molécula menos polar que el agua y es miscible en ella. V/F
Verdadero
El DNA no es soluble en etanol por lo que:
el DNA precipita
El RNA es más polar que el DNA, por lo tanto:
el RNA no precipita
¿Qué se debe hacer para insolubilizar aún más el DNA?
Disminuir la temperatura (incubación en hielo)
Después de la centrifugación en frío del DNA insolubilizado se obtiene:
una pastilla (pellet) blanca compacta en el fondo del tubo
Los lavados se realizan un par de veces con:
soluciones de etanol al 75%
El DNA se solubiliza en agua libre de nucleasas
Resuspensión del DNA
Nivel máximo de los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteínas
- AN → 260 nm
- P → 280 nm
El espectrofotómetro calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución en base a:
la absorbancia a 260 nm
La pureza se determina mediante el coeficiente…
260/280
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.8 - 2, la pureza del DNA es…
Óptima
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.6 - 1.8, la pureza del DNA es…
Aceptable
Si el coeficiente 260/280 es menor que 1.6, el DNA está…
contaminado con compuestos aromáticos y proteínas
Si el coeficiente 260/280 es mayor a 2.1, el DNA está…
contaminado con RNA
Para la extracción de RNA se utiliza el método del:
Fenol-Cloroformo
Rompe membranas, desnaturaliza proteínas y libera ácidos nucleicos de moléculas asociadas
Primer paso del Método del Fenol-Cloroformo
La adición de más cloroformo en el método de extracción separa las fases debido a que…
el fenol es más polar y el cloroformo es inmiscible en agua
En la extracción de RNA, el DNA menos polar que el RNA se queda entre:
las fases acuosa y fenólica junto con las proteínas
El RNA permanece disuelto en:
la fase acuosa
¿El isopropanol es menos polar que el etanol?
Si
Pasos para la extracción de RNA con el método Fenol-Cloroformo:
- Lisis celular
- Adición de fenol y cloroformo
- Precipitación ARN
- Centrifugar
- Lavar el pellet (EtOH 75%)
- Resuspender el ARN
- Coeficiente 260/280
Si el coeficiente 260/280 en muestras de RNA es de 2.0 a 2.2, la pureza del RNA es…
Óptima
Si el coeficiente 260/280 en muestras de RNA es mayor a 1.7, la pureza del RNA es…
Aceptable
Si el coeficiente 260/280 es menor a 1.7, la muestra de RNA está…
Contaminada con compuestos aromáticos y proteínas
Análisis principalmente de muestras de proteínas, aunque también para ácidos nucleicos en caso de que se requiera mayor resolución.
Geles de poliacrilamida
Analisis de muestras de ácidos nucleicos, no pueden ser observadas diferencias pequeñas en pesos moleculares de las moléculas analizadas
Geles de agarosa
Tipos de electroforesis en geles de agarosa:
- Convencional
- Campo pulsado
Factores extrínsecos a la partícula:
- Concentración de agarosa
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
La agarosa es un polisacárido formado por…
β-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y α-(1-3)-D-galactosa
¿La agarosa es soluble en agua a qué temperatura?
superiores a 65°C
Forma una matriz inerte y no tóxica
Agarosa
¿Cuál es la concentración tipica de agarosa?
de 0.5 a 4% (peso/volumen)
La movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa, V/F
Verdadero
Al aumentar el voltaje aumenta la movilidad y también la resolución, V/F
Falso, no necesariamente se incrementa la resolución
Para mejor resolución se necesita un voltaje…
menor (ej. 70 V)
Cuál sería el voltaje aplicado en geles de 10-15 cm
100 - 130 V
Voltaje aplicado típico
~10 V /cm de gel
A menor voltaje hay mayor…
difusión lateral
A menor tiempo de corrida, mayor resolución, V/F
Falso; a mayor tiempo de corrida mayor resolución
A mayor tiempo de corrida debemos de tener precaución para que:
no se salga la muestra del gel
La movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa al aumentar qué?
La temperatura
¿Qué pasa si se incrementa mucho la temperatura?
se puede fundir el gel
Normalmente cómo se mantiene la temperatura?
lo más baja posible
Agentes utilizados para el revelado/visualización de los ácidos nucleicos
- Bromuro de Etidio
- SYBR
Cuántos ng de dsDNA se detectan con el Bromuro de etidio
1 ng
Absorbe a 260-360 nm (UV) y emite fluorescencia rojo-naranja (560 nm)
Bromuro de etidio
¿Donde se agrega el bromuro de etidio?
en la agarosa o post corrida
Agente no intercalante, es una alternativa menos toxica, aunque menos sensible (3 ng)
SYBR
Mezcla de moléculas de diferente peso molecular que sirve como referencia para el análisis cualitativo de las muestras analizadas
Marcadores de peso molecular
Tipos de marcadores de peso molecular:
- Sintéticos
- DNA de fagos o plásmidos digeridos por enzimas de restricción
Cuando no se puede conocer el número exacto de pb de las bandas en el corrimiento de las muestras se habla de:
peso molecular aparente
Permite detectar interacciones entre la secuencia específica de ácido nucleico y alguna proteína funcional particular
EMSA
Analisis de retraso en gel, basado en la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas
Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)
Los complejos ácidos nucleicos-proteínas tienen un peso molecular mayor, por lo cual la movilidad del ácido nucleico….
disminuye
- Separación de grandes fragmentos de DNA.
- Reorienta la molécula mediante cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico
Electroforesis en gel de campo pulsado
Campo pulsado
Al aplicar E1 las cadenas de DNA…
se estiran y orientan en esa dirección
Campo pulsado
Al aplicar E2 más o menos perpendicular a E1, las cadenas de DNA….
se relajan, se elongan y se alinean en una nueva dirección
En la electroforesis en gel de campo pulsado, a las cadenas más largas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben menor movilidad. V/F
Falso, a las cadenas más cortas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
El ángulo α de reorientación (entre E1 y E2) es mayor de:
100°
Campo pulsado
Para evitar que el DNA se fragmente al cargar la muestra se utilizan…
disoluciones concentradas de alta viscosidad o células completas
¿El DNA genómico se puede digerir con enzimas de restricción previo al corrimiento electroforético?
Verdadero
Campos eléctricos no homogéneos:
- PFGE
- OFAGE
- TAFE
En los campos eléctricos no homogéneos, α disminuye. V/F
Falso, va incrementándose
Campos eléctricos homogéneos:
- FIGE
- CHEF
- RGE
En los campos eléctricos homogéneos α permanece constante. V/F
Verdadero
Cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar…
mayor es la duración de los pulsos aplicados y menor el voltaje
En la electroforesis capilar se utilizan:
capilares de sílice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas
Ventajas de la electroforesis capilar:
- permite obtener resultados en corto tiempo (5-60 min)
- mínimo consumo de muestra (nL)
- muy alta resolución (1nt de diferencia)
En la electroforesis capilar el campo eléctrico utilizado es bajo. V/F
Falso, es alto (100-500 V/cm)
Muy empleada en la secuenciación automatizada
Electroforesis capilar
Se corresponde al mRNA, carece de intrones y tiene menor peso molecular
cDNA de un gen eucarionte discontinuo
El DNA del gen discontinuo posee intrones, por lo tanto, su peso molecular es _____ al de su cDNA
mayor
La corriente eléctrica transmite su energía a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido y vibración.
Lisis celular por sonicación
Las millones de burbujas microscópicas generadas en el líquido durante la lisis celular por sonicación, sufren procesos de:
expansión y colapso
