Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
1
Q
Extracción de:
A
- DNA
- RNA
2
Q
Para cuantificar y determinar la pureza:
A
Espectrofotómetro
3
Q
Para purificación:
A
- Cromatografía de afinidad
- Electroforesis
4
Q
La electroforesis convencional en gel se usa para:
A
análisis cualitativo y cuantitativo
5
Q
Tipos de electroforesis en la purificación:
A
- Convencional
- Campo pulsado
- Capilar
6
Q
Es el primer paso en la tecnología del DNA recombinante:
A
Aislamiento del DNA
7
Q
La extracción de DNA sirve para:
A
- Amplificación
- Secuenciación
- Determinar polimorfismos
- Diagnóstico de enfermedades
- Transferencia génica
- Obtención de proteínas recombinantes
- Terapia génica
8
Q
¿Dónde se encuentra el DNA genómico de las células eucariotas?
A
en el núcleo
9
Q
El DNA mitocondrial de la célula eucariota se encuentra en:
A
la mitocondria
10
Q
Son compartimentos delimitados y rodeados por membranas:
A
El núcleo y la mitocondria
11
Q
¿En las células eucariotas encontramos DNA plasmídico?
A
No, solo se encuentra en las procariotas
12
Q
Pasos para la extracción de DNA genómico:
A
- Muestra de células
- Lisis celular
- Precipitación de proteínas
- Precipitación del DNA
- Lavados
- Resuspensión
- Cuantificación y determinación de pureza
13
Q
Ejemplo de muestras de células para la extracción de DNA:
A
- Cabello
- Piel
- Mucosa bucal
- Sangre
14
Q
El buffer de lisis contiene:
A
- 50 mM Tris-HCL, pH 8
- 1% SDS
- Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)
15
Q
Buffer que mantiene el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa
A
50 mM Tris-HCL, pH 8
16
Q
Detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA:
A
Dodecyl Sulfato de Sodio (SDS 1%)
17
Q
El SDS renaturaliza las proteínas dejándolas inaccesibles para las proteasas. V/F
A
Falso, las desnaturaliza y las deja accesibles
18
Q
Cuando el SDS entra en contacto con la célula captura los lípidos y las proteínas, mientras que el ácido nucleico permanece en solución. V/F
A
Verdadero
19
Q
Aislada del hongo Tritirachium album
A
Proteinasa K
20
Q
La proteinasa K es una serina proteasa que se activa…
A
bajo condiciones desnaturalizantes
21
Q
La proteinasa K es capaz de inactivar las:
A
RNAsas y DNAsas
22
Q
La proteinasa K incrementa:
A
- La pureza del DNA, menor contaminación por proteínas
- La calidad/cantidad de DNA no degradado
23
Q
Las proteínas se insolubilizan y precipitan, por ejemplo, con soluciones de acetona:
A
Precipitación de proteínas
24
Q
Si la muestra se centrifuga, en el pellet queda:
A
las proteínas y restos celulares
25
Si la muestra se centrifuga, en el sobrenadante se encuentra:
el ácido nucleico
26
En la precipitación del DNA se utiliza:
una alta concentración de sales (NaCl)
27
Los iones de Na+ neutralizan las cargas **positivas** de los grupos fosfato. V/F
Falso, los grupos fosfato poseen cargas negativas
28
Una alta concentración de sales en la precipitación del DNA hace que:
- las moléculas del DNA se junten en lugar de repelerse
- disminuya la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso
29
La precipitación del DNA se facilita al añadir:
alcohol
30
El etanol es una molécula menos polar que el agua y es miscible en ella. V/F
Verdadero
31
El DNA no es soluble en etanol por lo que:
el DNA precipita
32
El RNA es más polar que el DNA, por lo tanto:
el RNA no precipita
33
¿Qué se debe hacer para insolubilizar aún más el DNA?
Disminuir la temperatura (incubación en hielo)
34
Después de la centrifugación en frío del DNA insolubilizado se obtiene:
una pastilla (pellet) blanca compacta en el fondo del tubo
35
Los lavados se realizan un par de veces con:
soluciones de etanol al 75%
36
El DNA se solubiliza en agua libre de nucleasas
Resuspensión del DNA
37
Nivel máximo de los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteínas
* AN → 260 nm
* P → 280 nm
38
El espectrofotómetro calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución en base a:
la absorbancia a 260 nm
39
La pureza se determina mediante el coeficiente...
260/280
40
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.8 - 2, la pureza del DNA es...
Óptima
41
Si el coeficiente 260/280 es igual a 1.6 - 1.8, la pureza del DNA es...
Aceptable
42
Si el coeficiente 260/280 es menor que 1.6, el DNA está...
contaminado con compuestos aromáticos y proteínas
43
Si el coeficiente 260/280 es mayor a 2.1, el DNA está...
contaminado con RNA
44
Para la extracción de RNA se utiliza el método del:
Fenol-Cloroformo
45
Rompe membranas, desnaturaliza proteínas y libera ácidos nucleicos de moléculas asociadas
Primer paso del Método del Fenol-Cloroformo
46
La adición de más cloroformo en el método de extracción separa las fases debido a que...
el fenol es más polar y el cloroformo es inmiscible en agua
47
En la extracción de RNA, el DNA menos polar que el RNA se queda entre:
las fases acuosa y fenólica junto con las proteínas
48
El RNA permanece disuelto en:
la fase acuosa
49
¿El isopropanol es menos polar que el etanol?
Si
50
Pasos para la extracción de RNA con el método Fenol-Cloroformo:
1. Lisis celular
2. Adición de fenol y cloroformo
3. Precipitación ARN
4. Centrifugar
5. Lavar el pellet (EtOH 75%)
6. Resuspender el ARN
7. Coeficiente 260/280
51
Si el coeficiente 260/280 en muestras de RNA es de 2.0 a 2.2, la pureza del RNA es...
Óptima
52
Si el coeficiente 260/280 en muestras de RNA es mayor a 1.7, la pureza del RNA es...
Aceptable
53
Si el coeficiente 260/280 es menor a 1.7, la muestra de RNA está...
Contaminada con compuestos aromáticos y proteínas
54
Análisis principalmente de muestras de proteínas, aunque también para ácidos nucleicos en caso de que se requiera mayor resolución.
Geles de poliacrilamida
55
Analisis de muestras de ácidos nucleicos, no pueden ser observadas diferencias pequeñas en pesos moleculares de las moléculas analizadas
Geles de agarosa
56
Tipos de electroforesis en geles de agarosa:
* Convencional
* Campo pulsado
57
Factores extrínsecos a la partícula:
* Concentración de agarosa
* Voltaje aplicado
* Tiempo de corrida
* Temperatura
58
La agarosa es un polisacárido formado por...
β-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y α-(1-3)-D-galactosa
59
¿La agarosa es soluble en agua a qué temperatura?
superiores a 65°C
60
Forma una matriz inerte y no tóxica
Agarosa
61
¿Cuál es la concentración tipica de agarosa?
de 0.5 a 4% (peso/volumen)
62
La movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa, V/F
Verdadero
63
Al aumentar el voltaje aumenta la movilidad y también la resolución, V/F
Falso, no necesariamente se incrementa la resolución
64
Para mejor resolución se necesita un voltaje...
menor (ej. 70 V)
65
Cuál sería el voltaje aplicado en geles de 10-15 cm
100 - 130 V
66
Voltaje aplicado típico
~10 V /cm de gel
67
A menor voltaje hay mayor...
difusión lateral
68
A **menor** tiempo de corrida, mayor resolución, V/F
Falso; a mayor tiempo de corrida mayor resolución
69
A mayor tiempo de corrida debemos de tener precaución para que:
no se salga la muestra del gel
70
La movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa al aumentar qué?
La temperatura
71
¿Qué pasa si se incrementa mucho la temperatura?
se puede fundir el gel
72
Normalmente cómo se mantiene la temperatura?
lo más baja posible
73
Agentes utilizados para el revelado/visualización de los ácidos nucleicos
* Bromuro de Etidio
* SYBR
74
Cuántos ng de dsDNA se detectan con el Bromuro de etidio
1 ng
75
Absorbe a 260-360 nm (UV) y emite fluorescencia rojo-naranja (560 nm)
Bromuro de etidio
76
¿Donde se agrega el bromuro de etidio?
en la agarosa o post corrida
77
Agente no intercalante, es una alternativa menos toxica, aunque menos sensible (3 ng)
SYBR
78
Mezcla de moléculas de diferente peso molecular que sirve como referencia para el análisis cualitativo de las muestras analizadas
Marcadores de peso molecular
79
Tipos de marcadores de peso molecular:
- Sintéticos
- DNA de fagos o plásmidos digeridos por **enzimas de restricción**
80
Cuando no se puede conocer el número exacto de pb de las bandas en el corrimiento de las muestras se habla de:
peso molecular aparente
81
Permite detectar interacciones entre la secuencia específica de ácido nucleico y alguna proteína funcional particular
EMSA
82
Analisis de retraso en gel, basado en la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas
Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA)
83
Los complejos ácidos nucleicos-proteínas tienen un peso molecular mayor, por lo cual la movilidad del ácido nucleico....
disminuye
84
* Separación de grandes fragmentos de DNA.
* Reorienta la molécula mediante cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico
Electroforesis en gel de campo pulsado
85
Campo pulsado
Al aplicar E1 las cadenas de DNA...
se estiran y orientan en esa dirección
86
Campo pulsado
Al aplicar E2 más o menos perpendicular a E1, las cadenas de DNA....
se relajan, se elongan y se alinean en una nueva dirección
87
En la electroforesis en gel de campo pulsado, a las cadenas más **largas** les toma menos tiempo reorientarse y exhiben **menor** movilidad. V/F
Falso, a las cadenas más cortas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
88
El ángulo α de reorientación (entre E1 y E2) es mayor de:
100°
89
Campo pulsado
Para evitar que el DNA se fragmente al cargar la muestra se utilizan...
disoluciones concentradas de alta viscosidad o células completas
90
¿El DNA genómico se puede digerir con enzimas de restricción previo al corrimiento electroforético?
Verdadero
91
Campos eléctricos no homogéneos:
* PFGE
* OFAGE
* TAFE
92
En los campos eléctricos no homogéneos, α disminuye. V/F
Falso, va incrementándose
93
Campos eléctricos homogéneos:
* FIGE
* CHEF
* RGE
94
En los campos eléctricos homogéneos α permanece constante. V/F
Verdadero
95
Cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar...
mayor es la duración de los pulsos aplicados y menor el voltaje
96
En la electroforesis capilar se utilizan:
capilares de sílice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas
97
Ventajas de la electroforesis capilar:
- permite obtener resultados en corto tiempo (5-60 min)
- mínimo consumo de muestra (nL)
- muy alta resolución (1nt de diferencia)
98
En la electroforesis capilar el campo eléctrico utilizado es bajo. V/F
Falso, es alto (100-500 V/cm)
99
Muy empleada en la secuenciación automatizada
Electroforesis capilar
100
Se corresponde al mRNA, carece de intrones y tiene menor peso molecular
cDNA de un gen eucarionte discontinuo
101
El DNA del gen discontinuo posee intrones, por lo tanto, su peso molecular es _____ al de su cDNA
mayor
102
La corriente eléctrica transmite su energía a un sistema mecánico que la convierte en vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido y vibración.
Lisis celular por sonicación
103
Las millones de burbujas microscópicas generadas en el líquido durante la lisis celular por sonicación, sufren procesos de:
expansión y colapso
