Purificación de proteínas Flashcards
Para la purificación de una nueva proteína se emplea la experiencia y el sentido común, V/F
Verdadero
En la purificación de una nueva proteína se emplean diferentes métodos secuenciales de forma empírica hasta encontrar la mejor forma, V/F
Verdadero
Con cada paso de purificación la cantidad de muestra se hace:
más pequeña, la actividad especifica va siendo mayor
Los métodos más sofisticados y caros se usan al principio de la purificación, V/F
Falso, se reservan para el final
Cromatografía:
- En papel
- En capa fina
- En columna
- De intercambio iónico
- De exclusión molecular
- De afinidad
- Líquida de alto rendimiento
Tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida
- 1 dimensión (PAGE)
- 2 dimensiones (2D)
Técnica para fraccionar mezclas orgánicas al desplazarlas a través de una matriz.
Cromatografía
Es un poderoso método de separación en el que se aprovechan las diferencias en:
el coeficiente de partición entre una fase móvil y una fase estacionaria
Cociente entre las concentraciones de una sustancia en las dos fases formadas por dos disolventes inmiscibles en equilibrio
Coeficiente de partición
El coeficiente de partición mide:
La solubilidad diferencial de una sustancia en esos dos disolventes.
Mantienen sostenida la fase estacionaria
Soporte o matriz, la fase móvil acarrea a la muestra
Los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria tendrán un tiempo de retención menor, V/F
Falso, el tiempo de retención será mayor
Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
Retención
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil (eluyente), que puede ser un líquido o un gas
Desplazamiento
Migración de los componentes de una mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil.
Elución/Eluir
Los tipos de cromatografía dependen de:
La naturaleza de las fases estacionaria y
móvil
Tipos de cromatografía:
- Sólido-líquido
- Líquido-líquido
- Líquido-gas
- Sólido-gas
La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas
Cromatografía líquido-gas
La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido y la móvil es un líquido
Cromatografía líquido-líquido
Fase estacionaria de la cromatografía en papel:
Papel filtro
Para aminoácidos individuales o dipéptidos
Cromatografía en papel
Empleada por Sanger 1945 en la secuenciación de la insulina:
Cromatografía en papel
Fase estacionaria de la cromatografía en capa fina:
Placa adsorbente, los más usados sílica gel y alumina, adherida a un soporte de plástico, vidiro o aluminio
En la cromatografía en columna la fase estacionaria, se empaqueta en una columna para evitar que:
El aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases
La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se eluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades
Cromatografía en columna
Componentes que eluyen a diferentes velocidades podrán ser separados. V/F
Verdadero
En la cromatografía en columna los componentes pueden ser colectados para su análisis posterior. V/F
Verdadero
Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moléculas como las proteínas a distintos pH
Cromatografía de intercambio iónico
Mecanismo básico de la cromatografía de intercambio iónico:
Intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales cargados, unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble
Tipos de cromatografía de intercambio iónico:
- Intercambio catiónico
- Intercambio aniónico
Resina carga negativa
Intercambio catiónico
Intercambio catiónico débil
Ácido carboxílico
Intercambio catiónico fuerte
Ácido sulfónico
Resina carga positiva
Intercambio aniónico
Intercambio aniónico fuerte
Aminas cuaternarias
Intercambio aniónico débil
Aminas secundarias o terciarias
La separación se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentración de sales de la fase móvil para crear un gradiente
Intercambio iónico de péptidos
En el intercambio iónico de péptidos las moléculas con carga opuesta a la de la matriz migrarán más rápido que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria. V/F
Falso, migraran más lentamente
Llamada también filtración en gel
Cromatografía de exclusión molecular
Fase estacionaria de la cromatografía de exclusión molecular
Material poroso inerte
En la cromatografía de exclusión molecular el soluto se separa según su:
tamaño y estructura molecular
En la cromatografía de exclusión molecular, las moléculas grandes no entran dentro de las cavidades de la matriz y atraviesan libremente recuperándose en las primeras fracciones. V/F
Verdadero
En la cromatografía de exclusión molecular, las moléculas pequeñas entran en:
el laberinto de los espacios dentro de la matriz y son retrasadas
Es la cromatografía de mayor especificidad y selectividad para la purificación de biomoléculas.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se basa en la interacción especifica de dos moléculas, ¿cuáles son?
- Antígeno/anticuerpo
- Enzima/sustrato
- Receptor/ligando
Las moléculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria se liberan mediante:
un cambio del medio eluyente
Una de las dos moléculas que interaccionan en la cromatografía de afinidad se une covalentemente a la fase estacionaria. V/F
Verdadero
Condiciones en las que la interacción se debilita:
- pH
- Fuerza iónica
- Polaridad
- Solución de las moléculas inmovilizadas
Afecta al estado de ionización de las biomoléculas
pH
Concentración de sales, afecta las interacciones iónicas
Fuerza iónica
Solubilidad
Polaridad
Cromatografía líquida de alto rendimiento:
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC hace uso de bombas de alta presión para mover las moléculas a través de la columna. V/F
Verdadero
HPLC es ideal para:
analizar componentes no volátiles como también azúcares, vitaminas, drogas y metabolitos.
Determina la composición de la mezcla
HPLC analítica
Se pueden recuperar los componentes posteriormente a su análisis para estudios posteriores
HPLC preparativa
(HPLC)
El área bajo la curva de cada pico es proporcional a la cantidad/concentración de cada componente en la mezcla analizada. V/F
Verdadero
Herramienta molecular fundamental para aislar y purificar macromoléculas en base a su movilidad dentro de un soporte o matriz sólida en un campo eléctrico
Electroforesis
Tipos de muestras que pueden ser analizadas por electroforesis
- Ácidos nucleicos
- Proteínas
El medio de soporte sólido es un gel:
Electroforesis en gel
Análisis de muestras de ácidos nucleicos
Geles de agarosa
Análisis de muestras de proteínas, para ácidos nucleicos también es posible en caso de que se requiera mayor resolución que la que brinda la agarosa
Geles de poliacrilamida
En _______ no pueden ser observadas diferencias pequeñas en pesos moleculares de las moléculas analizadas.
agarosa
La movilidad de la molécula está en función de:
su peso molecular y su carga eléctrica
Permiten la separación de las macromoléculas
Sus diferentes movilidades
Separación por punto isoeléctrico
- Se incorpora una solución de anfolitos a un gel
- Se establece un gradiente de pH estable en el gel después de la aplicación de un campo eléctrico
- Se añade la solución de proteínas y se vuelve a aplicar el campo eléctrico
- Después de la tinción, se muestra que las proteínas se distribuyen a lo largo del gradiente de pH de acuerdo con sus valores de punto isoeléctrico
En la electroforesis las moléculas se mueven siempre hacia:
el electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molécula
Los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo, V/F
Verdadero
Factores intrínsecos de la molécula
- Carga eléctrica
- Peso molecular
Factores extrínsecos de la molécula
- Concentración del gel
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
2a dimensión
Separación por peso molecular
Separación por peso molecular
- Se coloca gel de enfoque isoeléctrico sobre gel de poliacrilamida SDS
- Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS
A mayor relación carga eléctrica/peso molecular, mayor _____
movilidad
Moléculas en donde la relación carga eléctrica/peso molecular no es constante
Proteínas
Moléculas en donde la relación carga eléctrica/peso molecular es constante
Ácidos nucleicos
Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante….
la movilidad queda en función del peso
molecular
Si el peso molecular incrementa, la movilidad:
disminuye
La movilidad electroforética en gel es en base a:
el peso molecular de la macromolécula
Geles de poliacrilamida:
- Acrilamida (C3H5NO)
- Bisacrilamida (C7H10N202)
Formación de polímeros (gel):
Acrilamida
Entrecruzamiento entre las cadenas de polímeros (gel):
Bisalcrilamida
Niveles de organización de las proteínas:
- Primaria
- Secundaria
- Terciaria
- Cuaternaria
Hacia qué dirección decrece el peso molecular
Hacia abajo
Hacia qué dirección decrece el punto isoeléctrico
Hacia la derecha
Es la secuencia de una cadena de aminoácidos:
Estructura primaria de las proteínas
Ocurre cuando ciertas atracciones están presentes entre hélices alfa y hojas plegadas:
Estructura terciaria de las proteínas
Las proteínas globulares presentan mayor movilidad, V/F
Verdadero
Proteína que consiste de más de una cadena de aminoácidos
Estructura cuaternaria de las proteínas
Las proteínas no tienen una relación carga eléctrica/peso molecular constante y su forma influye en la movilidad, por lo tanto, se emplea:
SDS en la preparación del gel de poliacrilamida
Ocurre cuando los aminoácidos en la secuencia interactúan a través de enlaces de hidrógeno:
Estructura secundaria de las proteínas
¿Hay relación forzosa entre PM, número de residuos y cadenas polipeptídicas?
No
Cuando el corrimiento electroforético observado puede representar a más de una cadena polipeptídica se emplean:
agentes desnaturalizantes reductores
SDS sobre la relación carga eléctrica/peso molecular se une a:
las zonas apolares del polipéptido
SDS sobre la relación carga eléctrica/peso molecular
1 molécula de SDS por cada 2 residuos de aminoácidos
SDS proporciona al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a:
la longitud de la cadena, por tanto, al peso molecular.
La carga negativa del SDS es menor que la carga original de la proteína. V/F
Falso, es mucho mayor
Agente desnaturalizante:
SDS sobre la estructura proteica
La repulsión electrostática creada por la unión del SDS rompe los enlaces no covalentes haciendo que la proteína:
pierda su conformación nativa
SDS sobre la estructura proteica, elimina las diferencias en conformación y su influencia sobre la movilidad de las diferentes proteínas que han de ser separadas en el gel. V/F
Verdadero
Pueden formar enlaces puentes de disulfuro en las proteínas:
Cisteínas
Ayudan a estabilizar estructuras terciarias y cuaternarias.
Puentes disulfuro
Los puentes disulfuro de las proteínas afectan la interpretación de la electroforesis porque:
cabe la posibilidad de que dos cadenas polipeptídicas independientes corran como si fueran una sola cadena de mayor peso molecular
Agentes desnaturalizantes reductores
Ditiotreitol (DTT) o β-Mercaptoetanol.
Puede determinar el número y tamaño de subunidades proteicas comparando la electroforesis bajo condiciones reductoras y no reductoras
Análisis de proteínas multiméricas
Permite visualizar el corrimiento electroforético
Azul de bromofenol
Carga del azul de bromofenol
Negativa por encima de pH 4.6
El peso molecular del azul de bromofenol debe ser menor que el de cualquier proteína. V/F
Verdadero
¿Dónde se adiciona el azul de bromofenol?
al buffer de carga de la muestra
Donde inicia el gel separador
Inicio de la corrida
Línea donde llega el Azul de bromofenol
Frente de corrida
Métodos de tinción para el revelado del gel
- Azul de Coomassie
- Tinción de plata
Puede detectar bandas de hasta 50 ng
Azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue)
Incrementa la sensibilidad de detección (50x).
Tinción de plata. (Silver stainning).
Separación por punto isoeléctrico, (isoelectroenfoque).
Electroforesis 1ra dimensión
Separación por tamaño, (peso molecular).
Electroforesis 2da dimensión
Es el pH al que un polianfólito tiene carga neta cero
Punto isoeléctrico
Son moléculas grandes como las proteínas que tienen muchos grupos ácidos o básicos
Polianfólitos
Molécula con PI bajo tendrá más:
grupos ácidos
Un PI alto indica:
predominancia de grupos básicos
Estudio de las variaciones de los niveles de expresión a nivel de proteína en determinados momentos y bajo ciertas condiciones de la célula que permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estadios fisiológicos
Proteómica cuantitativa
Proteoma
Conjunto completo de proteínas en un organismo
Proteínas que se pueden identificar y permiten diagnosticar la enfermedad o pronosticar la evolución de la misma
Biomarcadores
En las proteínas expresadas en 2 tejidos humanos hay
Proteínas en común y proteínas tejido específico
