Purificación de proteínas Flashcards
Para la purificación de una nueva proteína se emplea la experiencia y el sentido común, V/F
Verdadero
En la purificación de una nueva proteína se emplean diferentes métodos secuenciales de forma empírica hasta encontrar la mejor forma, V/F
Verdadero
Con cada paso de purificación la cantidad de muestra se hace:
más pequeña, la actividad especifica va siendo mayor
Los métodos más sofisticados y caros se usan al principio de la purificación, V/F
Falso, se reservan para el final
Cromatografía:
- En papel
- En capa fina
- En columna
- De intercambio iónico
- De exclusión molecular
- De afinidad
- Líquida de alto rendimiento
Tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida
- 1 dimensión (PAGE)
- 2 dimensiones (2D)
Técnica para fraccionar mezclas orgánicas al desplazarlas a través de una matriz.
Cromatografía
Es un poderoso método de separación en el que se aprovechan las diferencias en:
el coeficiente de partición entre una fase móvil y una fase estacionaria
Cociente entre las concentraciones de una sustancia en las dos fases formadas por dos disolventes inmiscibles en equilibrio
Coeficiente de partición
El coeficiente de partición mide:
La solubilidad diferencial de una sustancia en esos dos disolventes.
Mantienen sostenida la fase estacionaria
Soporte o matriz, la fase móvil acarrea a la muestra
Los componentes de la muestra que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria tendrán un tiempo de retención menor, V/F
Falso, el tiempo de retención será mayor
Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
Retención
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil (eluyente), que puede ser un líquido o un gas
Desplazamiento
Migración de los componentes de una mezcla retenidos a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil.
Elución/Eluir
Los tipos de cromatografía dependen de:
La naturaleza de las fases estacionaria y
móvil
Tipos de cromatografía:
- Sólido-líquido
- Líquido-líquido
- Líquido-gas
- Sólido-gas
La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas
Cromatografía líquido-gas
La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido y la móvil es un líquido
Cromatografía líquido-líquido
Fase estacionaria de la cromatografía en papel:
Papel filtro
Para aminoácidos individuales o dipéptidos
Cromatografía en papel
Empleada por Sanger 1945 en la secuenciación de la insulina:
Cromatografía en papel
Fase estacionaria de la cromatografía en capa fina:
Placa adsorbente, los más usados sílica gel y alumina, adherida a un soporte de plástico, vidiro o aluminio
En la cromatografía en columna la fase estacionaria, se empaqueta en una columna para evitar que:
El aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases
La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se eluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades
Cromatografía en columna
Componentes que eluyen a diferentes velocidades podrán ser separados. V/F
Verdadero
En la cromatografía en columna los componentes pueden ser colectados para su análisis posterior. V/F
Verdadero
Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moléculas como las proteínas a distintos pH
Cromatografía de intercambio iónico
Mecanismo básico de la cromatografía de intercambio iónico:
Intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales cargados, unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble
Tipos de cromatografía de intercambio iónico:
- Intercambio catiónico
- Intercambio aniónico
Resina carga negativa
Intercambio catiónico
Intercambio catiónico débil
Ácido carboxílico
Intercambio catiónico fuerte
Ácido sulfónico
Resina carga positiva
Intercambio aniónico
Intercambio aniónico fuerte
Aminas cuaternarias
Intercambio aniónico débil
Aminas secundarias o terciarias
La separación se optimiza cambiando gradualmente el pH y/o la concentración de sales de la fase móvil para crear un gradiente
Intercambio iónico de péptidos
En el intercambio iónico de péptidos las moléculas con carga opuesta a la de la matriz migrarán más rápido que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria. V/F
Falso, migraran más lentamente
Llamada también filtración en gel
Cromatografía de exclusión molecular
Fase estacionaria de la cromatografía de exclusión molecular
Material poroso inerte
En la cromatografía de exclusión molecular el soluto se separa según su:
tamaño y estructura molecular
En la cromatografía de exclusión molecular, las moléculas grandes no entran dentro de las cavidades de la matriz y atraviesan libremente recuperándose en las primeras fracciones. V/F
Verdadero
En la cromatografía de exclusión molecular, las moléculas pequeñas entran en:
el laberinto de los espacios dentro de la matriz y son retrasadas
Es la cromatografía de mayor especificidad y selectividad para la purificación de biomoléculas.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se basa en la interacción especifica de dos moléculas, ¿cuáles son?
- Antígeno/anticuerpo
- Enzima/sustrato
- Receptor/ligando
Las moléculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria se liberan mediante:
un cambio del medio eluyente
Una de las dos moléculas que interaccionan en la cromatografía de afinidad se une covalentemente a la fase estacionaria. V/F
Verdadero
Condiciones en las que la interacción se debilita:
- pH
- Fuerza iónica
- Polaridad
- Solución de las moléculas inmovilizadas
Afecta al estado de ionización de las biomoléculas
pH