Inmunotécnicas Flashcards
Puede considerarse una inmunotécnica al emplearse un anticuerpo específico contra la proteína de unión al ácido nucleico
EMSA
Inmunotécnicas microscopía
- Inmunohistoquímica
- Inmunofluorescencia
- Confocal de fluorescencia
Inmunotécnica al emplearse un anticuerpo específico contra la proteína de unión al ácido nucleico
Antígeno
¿Cuántos epítopes tiene un antígeno?
uno (al menos) o más epítopes
Región de la molécula del antígeno que es reconocida por el anticuerpo, formada por aminoácidos
Epítope
Es especifica de cada especie
Región constante (Fc)
Anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B
Anticuerpo monoclonal
Son una mezcla heterogénea de anticuerpos producidos por diferentes clones de células B
Anticuerpos policlonales
Es una herramienta para identificar y localizar antígenos (proteínas) en una muestra de tejido
Inmunohistoquímica
Anticuerpo primario específico para el antígeno que estamos tratando de identificar, acoplado a una enzima
Inmunohistoquímica método directo
Anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno que estamos tratando de identificar
Inmunohistoquímica método indirecto
Anticuerpo secundario, contra la Fc la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario, acoplado a una enzima
Método indirecto Inmunohistoquímica
Metodología de inmunohistoquímica:
- Fijación
- Cortes
- Incubación con anticuerpos
- Cromógeno para la enzima
- Montaje
Inmoviliza las células y las preserva. Une
covalentemente las moléculas proteicas a sus vecinas
Fijación
Agentes utilizados para la fijación de las muestras:
- Formaldehído
- Glutaraldehído
- Citrato pH 6
- EDTA pH 9
Sistema de detección o visualización
Cromógeno para la enzima.
Indica replicación activa del virus de la hepatitis B en el hígado
HBcAg y HBsAg
Detectar específicamente algunas proteínas u otras moléculas en células y tejidos
Microscopio de fluorescencia
Molécula fluorescente
Fluorocromo
Parte del fluorocromo que absorbe la luz de una determinada longitud de onda y emite luz de otra longitud de onda más larga
Fluoróforo
Anticuerpo primario específico para el antígeno (Ag) que estamos tratando de identificar, acoplado a un fluorocromo (F)
Microscopio de fluorescencia: Método directo
Anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno (Ag) que se está estudiando
Microscopio de fluorescencia: Método indirecto
- Anticuerpo secundario acoplado a un fluorocromo (F)
Microscopio de fluorescencia: Método indirecto
En el método indirecto de la M. de fluorescencia el anticuerpo secundario reconoce específicamente la región constante (Fc) de la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario. V/F
Verdadero
Superposición espacial entre dos etiquetas fluorescentes diferentes
Colocalización
Visualización de diferentes moléculas al mismo tiempo en una preparación
Contratinción
Deja pasar solamente la luz de cierta longitud de onda
- Filtro
Refleja la luz de cierta longitud de onda y transmite la luz de otra longitud de onda mayor
- Espejo dicroico
Deja pasar la señal fluorescente de cierta longitud de onda específica
- Filtro
Identifica las regiones en proceso síntesis activa de DNA
BrdU (bromodesoxiuridina)
Colocalizan en regiones de síntesis activa de DNA.
DNA polimerasa y PCNA
Antígeno nuclear de células en proliferación (siglas)
PCNA
Permite obtener una imagen de la arquitectura tridimensional de una célula o un tejido
Microscopio confocal de fluorescencia
El microscopio confocal de fluorescencia utiliza métodos electrónicos que permiten:
enfocar un plano de una muestra eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores e inferiores a ese plano
A partir de una serie de secciones ópticas obtenidas a diferentes profundidades, archivadas en un ordenador, resulta sencillo construir una imagen tridimensional. V/F
Verdadero
En el proceso de obtención de secciones finas, se pierde información respecto a la tercera dimensión. V/F
Verdadero
Se emplea en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas y presencia de biomarcadores
Citometría de flujo
Características morfológicas:
- Tamaño
- Granularidad
Marcados específicamente mediante anticuerpos acoplados a fluorocromos
Presencia de biomarcadores
Mide la dispersión de la luz en un ángulo de 90 grados con respecto al láser y proporciona información sobre la complejidad celular
SSC
Mide la dispersión de la luz en la misma dirección que el láser y proporciona información sobre el tamaño celular
FSC
En el marcaje con fluorescencia se puede detectar cualquier molécula en la célula, siempre y cuando tengamos:
un anticuerpo específico para ella, acoplado a un fluorocromo
En el marcaje con fluorescencia las células:
- Pueden contarse.
- Pueden ser separadas y recuperadas.
En las poblaciones leucocitarias, la baja cantidad de eosinófilos y basófilos hace que en general no se defiendan en base a FSC y SSC, V/F
Verdadero
Compuesto que atraviesa la membrana celular alterada en células muertas y las tiñe
Ioduro de propidio
Las células vivas presentan fluorescencia en la pureza y viabilidad de poblaciones celulares. V/F
Falso, no presentan fluorescencia en ese canal
¿Qué significa ELISA?
Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay
“Ensayó de inmunoadsorción ligado a enzima”
Permite evaluar a una proteína de manera cuantitativa
ELISA
Ej. Detección de Ag en sangre u orina
ELISA: Directo
Ej. Detección de Ag con un solo secundario acoplado a enzima-cambiando el primario- o detección de anticuerpos (HIV, SARS-CoV-2)
ELISA: Indirecto
Ej. Detección de Ag, más sensible, el Ag se retiene en la placa mediante su unión específica al anticuerpo de captura y el segundo Ag es policlonal, se amplifica la señal VS directo e indirecto
ELISA: Tipo sándwich
Etapas del Western Blot
- Electroforesis
- Transferencia
- Inmunodetección.
Tipos de transferencia en el Western Blot
- Electrotransferencia
- Difusión simple o pasiva
Permite la detección mediante un anticuerpo específico, de una proteína dentro de una muestra biológica
Western Blot
Las isoformas son reconocidas por el mismo anticuerpo y tienen el mismo peso molecular. V/F
Falso, podrían ser reconocidas por el mismo anticuerpo, pero variarán en peso molecular.
Estima el tamaño de la proteína
Corrimiento electroforético
Variantes alelicas que generan distintas formas de la misma proteína, splicing alternativo o maduración diferencial
Isoformas
Western Blot se utiliza para:
- Estimar el tamaño de la proteína
- Evidenciar isoformas
- Comparar los niveles de proteína entre muestras
Proteína blanco inalterada y se asume que conserva su función y localización normal.
Proteína de fusión con una etiqueta de epítopo
Secuencia proteica corta que es reconocida fuertemente por un anticuerpo comercial bien caracterizado.
Etiqueta de epítopo
La proteína de fusión con una etiqueta de epítopo se puede emplear para:
- Inmunofluorescencia
- Inmunoprecipitación
En la inmunofluorescencia el anticuerpo está unido a:
un fluorocromo
Permite identificar interacciones funcionales proteína-proteína con proteínas hasta ese momento desconocidas
Inmunoprecipitación
En la inmunoprecipitación, el complejo proteico puede estar formado por varias proteínas. V/F
Verdadero
Una variante de la inmunoprecipitación puede ser:
La purificación del complejo proteico por columna de afinidad
En la purificación del complejo proteico por columna de afinidad, el anticuerpo es inmovilizado en la columna. V/F
Verdadero
