Investigación en enfermedades causadas por virus Flashcards
El hecho de que una célula sea susceptible a la infección no garantiza que…
la replicación viral se lleve a cabo, así como tampoco que el individuo que se infecte sufra la enfermedad
El estudio de virus requiere poder cultivarlos a través de:
Inoculación de una preparación de viriones a hospederos vivos o a cultivos celulares permisibles adecuados
Cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica,
Efectos citopáticos
Efectos citopáticos:
- Perdida de adherencia al sustrato e Inhibición por contacto
- Redondeamiento celular
- Agregación celular
- Formación de sincitios
- Cuerpos de inclusión
Las partículas virales son:
De gran tamaño con respecto a los componentes moleculares de la célula y más estables que las estructuras celulares
Tipos de centrifugación usadas para la purificación de virus:
- Centrifugación diferencial
- Centrifugación en gradiente de densidad
Las diferentes fracciones de virus se separan según sus tamaños y densidades relativas. Implica una serie de centrifugaciones a diferentes velocidades para separar los virus de otros componentes celulares y del medio de cultivo.
Centrifugación diferencial
Con este método, se crea un gradiente de densidad en equilibrio en el tubo de centrifugación. Se logra mediante el uso de cloruro de cesio o la sacarosa, que se mezcla con la muestra.
Centrifugación en gradiente de densidad isopícnica
No distingue partículas infecciosas de no infecciosas
Titulación de virus físicos
Distingue partículas infecciosas de no infecciosas
Titulación de virus biológicos
Titulación de virus físicos:
- Microscopía electrónica
- Hemaglutinación
- qPCR
- Medición de la densidad óptica
Titulación de virus Biologicos:
- Método de punto final
- Concentración de unidades infecciosas
Numero de genomas virales por célula
qPCR (PCR Tiempo real)
Réplicas de diluciones seriadas que son inoculadas y permite determinar la dilución que resultó en la infección del 50% de las réplicas
Método de punto final
Titulación de virus biológicos por concentración de unidades infecciosas:
- PFU
- Ensayo de enfoque
Muestra del stock viral mezclada con una concentración conocida de partículas de látex
Titulación viral por microscopia electrónica
Unidad de hemaglutinación (UHA)
Mínima cantidad de virus requerida para causar aglutinación
Muchos virus tienen la capacidad de expresar proteínas de unión a la célula a través del reconocimiento del ácido siálico presente también en los eritrocitos, ¿verdadero o falso?
Verdadero
Paso 1 de la titulación viral por PFU
Cultivo celular en cajas Petri
Paso 2 de la titulación viral por PFU
Agregar un medio semisólido
Paso 3 de la titulación viral por PFU
Aparición de placas líticas
Paso 4 de la titulación viral por PFU
Cuantificación de las placas líticas
El número de placas líticas observadas en la monocapa celular va en relación con:
el número de partículas virales viables que había en la suspensión viral utilizada para la infección inicial
Para virus transformantes. Las células crecen como focos o pilas de células que se tiñen y pueden ser contadas
Titulación viral por ensayo de enfoque
Cantidad promedio de virus que se adiciona por cada célula en una infección. Muy importante en protocolos de investigación
Multiplicidad de la infección MOI
Asegura que todas las células en el cultivo están infectadas y lo más sincronizadas posibles
MOI 10
Viroplasmas:
Inclusiones citoplasmáticas densas en donde se replica el dsRNA y se empaquetan las partículas virales
Ejemplos de viroplasmas
Rotavirus y miembros de la familia Reoviridae
Cómo comienza la entrada del virus a una célula animal:
Con la unión del virus a la superficie celular a través de receptores/factores de unión de diversa naturaleza
La mayoría de virus envueltos son _____ en vez de fusionarse directamente con la membrana celular
Endocitados
La cápside se transporta al núcleo donde se decapsida el genoma y se replica, ¿en qué virus?
En la mayoría de virus de DNA y unos pocos de virus de RNA
Moléculas de superficie que unen al virus a la célula y promueven su entrada
Receptores
Ayudan a concentrar las partículas virales en la superficie celular incrementando su entrada:
Factores de unión
Los receptores:
- Inducen cambios conformacionales en el virus que promueven la fusión membranal y penetración
- Transmiten señales a través de la membrana que conducen a la penetración y preparan a la célula para la invasión
- Guían al virus a través de la vía endocítica
Los factores de unión:
- No promueven activamente la entrada del virus ni median señales
- Las interacciones con el virus no son altamente especificas
Secuencia de eventos en la fusión viral a la membrana celular:
- Segmentos de una proteína de fusión son insertados en la membrana blanco
- La proteína viral se repliega poniendo en cercanía a ambas membranas viral y celular
- Ambas membranas v y c se fusionan formando un poro por el cual atraviesa el virus
Fusión membranal Clase I
Hélices α
Fusión membranal Clase II
Barriles
Fusión membranal Clase III
Proteína G con dos asas hidrofóbicas
Sus estructuras exponen residuos hidrofóbicos que son acomodados dentro de las cadenas alifáticas que constituyen las membranas
Hélice α, barril β, proteína G
No es infectiva ya que es incapaz de fusionarse con las membranas celulares a través del dominio III
Partícula viral inmadura
Cambios conformacionales en la fusión membranal clase II DENV
Se expone el péptido de fusión del extremo distal del dominio II al disminuir el pH del endosoma, el cual se inserta a sí mismo en la membrana, habiéndose formado el barril β
Secuencia hidrofóbica de aprox 12 residuos de aminoácidos (98-100) esencial para la fusión del DENV con la célula hospedera
Péptido de fusión
De los 15 tipos de HA, ¿cuáles son las mas comunes en virus que afectan a los humanos?
H1, H2 y H3
Proteína situada en la envoltura viral, reconoce al ácido siálico en células del sistema respiratorio.
Hemaglutinina
Evita que el virus quede atascado en la superficie celular cuando salga de la célula recién infectada
- Baja afinidad por el receptor
- Enzima que destruya al receptor
- Disminución de la expresión del receptor en la célula infectada
- Ruptura catalítica de una proteína estructural durante la maduración
Remueve el ácido siálico de la membrana permitiendo que el virus abandone la célula:
Neuraminidasa (influenza)
La neuraminidasa se clasifica en nueve tipos, siendo __ y __ las más frecuentes en humanos
N1 y N2
ssRNA del SARS-CoV 2
(+) 30,000 nt
Proteínas estructurales del SARS-CoV 2
- S
- E
- M
- N
Homotrímero de glicoproteína cuyo ensanchamiento distal de sus pliegues forma las puntas de la superficie. Une su dominio al receptor celular de ECA2/ACE2
Proteína S (spike)
Pequeña proteína de envoltura del SARS-CoV2
Proteína E
Proteína de la matriz que une la envoltura con el núcleo vírico
Proteína M
Fosfoproteína de la nucleocápside
Proteína N
Oncoproteína, inhibe a p53, regulador negativo del ciclo celular, supresor tumoral, factor de transcripción para la apoptosis
Proteína E6
Oncoproteína, inhibe a Rb (retinoblastoma, proteína supresora tumoral) permite que la célula progrese a través del ciclo celular en ausencia de signos mitogénicos normales
Proteína E7
Inhibición de la diferenciación de queratinocitos. Incremento y desorganización de las células basales. Incremento en la expresión de E6 y E7.
-60% regresión NIC3
VPH persistente. Infección abortiva
Diferenciación de queratinocitos, baja expresión de E6 y E7
-90% regresión NIC3
VPH transitoria. Infección productiva
Progresión de la enfermedad cervical:
- Expresión génica celular alterada
- Expresión génica viral alterada
- Cambios epigéneticos
- Integración del genoma viral, mutagénesis insercional
- Cáncer
Cambios epigéneticos:
Metilación DNA viral y celular, microRNAs
