Secuenciación de proteínas y cristalografía Flashcards
La secuencia de aminoácidos en un péptido o una proteína está especificada genéticamente, V/F
Verdadero
Si una proteína se aísla puede analizarse para encontrar:
la secuencia de aminoácidos que la conforman
Se clona la secuencia de ácidos nucleicos que la codifican y se clona a su vez la proteína para su estudio pudiendo hacer cambios en la secuencia
Análisis funcionales y/o estructurales de péptidos
Flujo de trabajo
- Extracción de proteínas
- Separación de las proteínas
- Procesamiento para secuenciación
Separación de las proteínas
- SDS PAGE
- 2D criterio de pureza
- Cromatografía de exclusión molecular, de afinidad, de intercambio iónico
Procesamiento para secuenciación
- Agentes reductores
- Alquilación de cisteínas
- Hidrólisis completa
- Digestiones individuales
De los métodos para fragmentar cadenas polipeptídicas, todos son proteasas excepto:
El bromuro de cianógeno
Eliminan puentes disulfuro
-Agentes reductores
Evitan puentes disulfuro
Alquilación de cisteínas
La ruptura de la cadena polipeptídica puede ocurrir en
el extremo carboxilo o en el amino del aa indicado
Reacciones para identificar el aminoácido N-t
- Edman
- Sanger
Espectrometría de masas
- MALDI
- ESI
- MS/MS
- Reacciones para identificar el N-t
- Espectrofotometría de masas
Secuenciación de proteínas
Reactivo de Sanger
2,4-dinitro-fluoro-fenilo
Empleada en secuenciadores automáticos
Degradación de Edman
Reactivo de Edman
Fenilisotiocianato
Con la degradación de Edman se puede hidrolizar la proteína original y realizar la secuenciación de cada fragmento, V/F
Verdadero
Reactivo de Edman
Fenilisotiocianato
Los secuenciadores automáticos solo pueden secuenciar los primeros 20 aminoácidos del extremo C-t, V/F
Falso, sólo pueden secuenciar los ~40 primeros aminoácidos del extremo N-t
La secuencia de una proteína es única
Huella digital de la proteína
Una proteína al ser cortada origina:
un patrón peptídico específico
Los valores exactos del conjunto de las masas moleculares de los péptidos es la representación única de:
La estructura primaria de una determinada proteína
Información bidimensional que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en función de la relación masa/carga de cada uno de ellos
Espectro de masas
El espectro de masas evidencia la relación masa/carga (m/z) de los péptidos analizados y se convierte en:
una huella digital de la proteína analizada
Componentes básicos de la espectrometría de masas
- Sistema de ionización
- Analizador de masas
- Detector de iones
- Vaporización e ionización a partir de moléculas neutras
- Requieren muy poca cantidad de muestra
Sistema de ionización
Separación de los iones en función de su relación masa/carga eléctrica, usando campos electromagnéticos en el vacío
Analizador de masas
Detección de los iones formados y registro adecuado de la información
Detector de iones
El analizador de masas permite deducir la masa de la molécula con mucha precisión, V/F
Verdadero
Para muestras en fase sólida
MALDI
Para muestras en fase liquida
ESI
Analizadores de masas
- TOF (Time of flight)
- TOF-TOF
- Trampa de iones tridimensional
- Q (Quadrupolo)
La muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de TOF, V/F
Verdadero
TOF-TOF
El aislamiento no funciona cuando el espectro está:
demasiado congestionado
Para una energía determinada, los iones más pesados se desplazan más lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
TOF
Se puede abrir y cerrar rápidamente la compuerta de paso entre el primer tubo y el TOF tube
TOF-TOF
Los iones son atrapados aplicando una radiofrecuencia en la dirección radial y un potencial continuo repulsivo en la lente de salida
Trampa de iones tridimensional
Funciona como un verdadero filtro de masas
Quadrupolo
En la trampa de iones, después de que se acumulan, los iones salen de la trampa mediante un voltaje auxiliar. V/F
Verdadero
El quadrupolo se compone de:
4 barras metálicas de sección circular o hiperbólica, rectas y paralelas
En el quadrupolo se aplica un potencial constante V que origina:
un movimiento lateral oscilante de los iones
Es una técnica de estado único que proporciona iones en pulsos que se adaptan mejor a la EM de tiempo de vuelo
MALDI
Es una técnica de solución que proporciona un flujo continuo, ideal para quadrupolo, trampas de iones, etc
ESI
Esencialmente 2 espectrómetros en tandem
MS/MS
Se detecta el flujo iónico, se amplifica y se transmite a la computadora, donde se registra en forma de un espectro de masas
Detección de iones e interpretación
Qué hay en el eje de las abscisas (x)
La masa de los iones
Qué hay en el eje de las ordenadas (y)
La intensidad (abundancia) de los iones
El espectro de masas evidencia:
el número de componentes en la muestra y el peso molecular de cada componente
En la interpretación se pueden determinar:
- Cofactores unidos
- Iones metálicos
- Modificaciones covalentes
Método para determinar la estructura tridimensional de una macromolécula mediante el análisis del patrón de difracción de los rayos x por un compuesto cristalino
Cristalografía de rayos x
Determina la separación de los átomos en una red cristalina midiendo las ubicaciones de manchas producidas en una película fotográfica por un haz de rayos x difractado
La cristalografía de rayos x
Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar 2 puntos como entidades separadas
Resolución
La resolución depende de:
La longitud de onda de la luz
A menor longitud de onda de la luz, mayor resolución. V/F
Verdadero
Un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede utilizarse para examinar detalles estructurales más pequeños que su propia longitud de onda (V o F)
Verdadero
Distancia entre los puntos que resuelven
Los rayos x tienen longitudes de onda comparables a
Las distancias atómico (0.1 nm) - moleculares (10 nm = 1x10^9 m) a 10 picometros (1x10^-12 m)
Cómo se producen los rayos X
al someter una carga eléctrica a una aceleración (lanzar electrones sobre un metal)
¿Los electrones de las proteínas emiten rayos X?
Si
Los electrones oscilan (se aceleran) conforme pasa la onda. V/F
Verdadero
La emisión de los electrones es en una sola dirección. V/F
Falso, es en todas direcciones
Las emisiones de varios electrones experimentan interferencia en diferentes direcciones (V o F)
Verdadero
En la pantalla aparece una mancha
Interferencia constructiva
En la pantalla no hay señal
Interferencia destructiva
Regiones brillantes
interferencias constructivas
Regiones oscuras
interferencias destructivas
La amplitud de las ondas se incrementa cuando:
se encuentran en fase
En el patrón de difracción, veremos en la pantalla regiones brillantes y regiones oscuras en un patrón complicado que no pueden verse en una lente, pues tienen que:
ser interpretado por una transformación matemática
En el patrón de difracción, veremos en la pantalla
regiones brillantes y regiones oscuras
Las distancias de las manchas son:
Inversamente proporcional a las distancias en la red real
En la degradación de Edman se obtiene:
feniltiohidantoína del aminoácido N-terminal y el resto del péptido queda intacto.
