Hibridación de ácidos nucleicos Flashcards
Simple y poderosa forma de detectar secuencias específicas de nucleótidos empleando sondas marcadas:
Hibridación de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos involucrados en la hibridación proceden de:
fuentes diferentes, previamente no formaban una doble cadena
Son de cadena sencilla y su reconocimiento es altamente específico:
Sondas
Tipos de hibridación:
- Hibridación In situ
- Southern Blot
- Northern Blot
- Dot Blot
- Hibridación de colonias o placas
Tecnica de marcaje de cromosomas que permite mapear la ubicación relativa de secuencias diferentes a lo largo de secuencias únicas de DNA mediante la hibridación de sondas que emiten fluorescencia
Fluorescent in situ Hybridization (FISH)
Fluorescent in situ Hybridization (FISH) fue desarrollada en:
1969 con marca radiactiva
Cuándo se realiza FISH?
- cuando se sospecha de una anormalidad cromosómica en algún sx concreto habiendo excluido otras posibilidades no genéticas
- localizar la expresión génica en un tejido
Tipos de sondas:
- Especificas de locus
- Fusión dual
- Doble color para ruptura
- Centroméricas
- Teloméricas
Específicas para una región cromosómica unica.
Sondas específicas de locus
En las anomalías cromosómicas numéricas, en la imagen deben verse, ¿cuántas señales por núcleo?
dos por núcleo
¿La deleción o duplicación de la región cromosómica dará origen a cuántas señales?
uno o dos, respectivamente
Anomalías cromosómicas numéricas (aneuploidías)
- Trisomía
- Monosomía
Anomalías cromosómicas estructurales:
- Deleción
- Duplicación
- Se unen a regiones contiguas al punto de traslocación
- Observada como una señal conjunta
Sondas Fusión dual
Anomalía cromosómica estructural en donde se transfiere una parte de un cromosoma a otro
Translocación
- Revelan eventos de traslocación
- Se unen al cromosoma intacto flanqueando el punto de ruptura
Sondas Doble color para ruptura
Sondas Doble color para ruptura
Cuando la translocación ocurre, la sonda…
se separa
Hibridan en las regiones repetidas que rodean los centrómeros. Pueden detectar aneuploidía de cualquier cromosoma
Sondas centroméricas (satélites)
Útiles para revelar pequeñas deleciones o translocaciones que no son fáciles de visualizar en el cariotipo estándar
Sondas Teloméricas
Su objetivo es identificar secuencias de interés en el ácido nucleico inmovilizado en una matriz de papel, nylon o nitrocelulosa
Southern y Northern Blot
Cómo es la transferencia en Southern y Northern Blot?
Pasiva o electrotransferencia
DNA genómico digerido previamente con enzimas de restricción
Southern Blot
Análisis de expresión. Niveles de mRNA
Northern Blot
Sonda marcada o acoplada a una etiqueta
- Fósforo radiactivo (32P)
- Digoxigenina (DIG)
- Anticuerpo acoplado a fosfatasa alcalina
- Anticuerpos específicos a αDIG
- Sustrato quimioluminiscente
Digoxigenina
Para la interpretación se debe considerar la muestra que se está analizando y lo que representa el que haya o no reconocimiento específico de la sonda empleada
Southern Blot
Analisis de expresión de genes:
- Niveles de la proteína (proteómica)
- Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
- RT-qPCR
- Northern Blot
- Microarreglos
Analiza el nivel de expresión de un gen relacionado con el cuadro clínico
Northern Blot
Util tanto para muestras de DNA y RNA
Dot Blot
En vez de hacer la separación electroforética en gel de cada una de las muestras, éstas se aplican con un capilar en la membrana directamente
Dot Blot
Dot Blot permite analizar de forma rápida la presencia de una secuencia especifica en una muestra determinada. V/F
Verdadero
La membrana se pone en contacto con las colonias
Hibridación de colonias o placas
La membrana se trata de forma que se promueve que el DNA o RNA quede expuesto y pueda hibridar con la sonda marcada
Hibridación de colonias o placas
La colonia identificada por hibridación de colonias, ¿puede ser resembrada y expandida?
Si
