2.4 GENÉTICA BACTERIANA

Question 1

propriedades

Answer 1

• Las mutaciones son espontáneas y el ambiente sólo juega un papel selector.
• La frecuencia es muy baja: 10-8 (por generación y por gen).
• Son las responsables de la evolución junto a la recombinación.

Question 2

Mutaciones

Answer 2

alteración de la secuencia de bases de un gen, un cambio en el genotipo estable y heredable, aunque no siempre conlleve a un cambio fenotípico observable o detectable.

Question 3

1.2. Tipos de mutaciones según su efecto fenotípico

Answer 3

a). Silenciosas
b). Letales
c). No letales:

Question 4

no letales

Answer 4

originan cambios fenotípicos
1. morfológicos
-afectan a flagelos, fimbrias, cápsulas, etc.
2. metabolismo y nutrición
- afectan a las fuentes de C, N, P y S.
- afectan a los factores de crecimiento: prototrofo-
auxotrofo
3. resistencia a antibióticos o bacteriófagos

Question 5

1.3. Tipos de mutaciones según su mecanismo molecular

Answer 5

a). Mutaciones puntuales: transición y transversión
b). Mutaciones por desplazamiento de la pauta de lectura (frameshift)
c). Grandes deleciones (o borraduras)
d). Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles: secuencias de inserción (IS) y transposones (Tn)
e). Otras: Inversiones y duplicaciones en tándem

Question 6

a). Mutaciones puntuales: transición y transversión

Answer 6

-Son sustituciones de pares de bases.
Bases púricas: Adenina (A) y Guanina (G)
Bases pirimidínicas: Timina (T) y Citosina (C)

1. transicion :
   Base púrica X base púrica Base pirimidínica X base pirimidínica
   A X G
   T X C
2. Transversión
   Base púrica X Base pirimidínica
   Base pirimidínica X Base púrica

A- T
T-A
o G-C
C-G

Question 7

consequencias de mutaciones pontuales

Answer 7

1. Mutación con cambio de sentido- causa formacion de una poteina no fonctional
2. Mutación sin sentido- forma proteina incompleta

3.Mutación silenciosa - forma proteina normal

Question 8

Mutaciones por desplazamiento de la pauta de lectura

Answer 8

-Por pérdida o ganancia de un pequeño número de nucleótidos que causa adicion o diminuicion de amino acidos codificados por mRNa o causa cambio de aa codificados

Question 9

Mutaciones insercionales

Answer 9

Ocasionadas por elementos genéticos transponibles

1. Secuencia de inserción:
   - hecho por la tranposasa
   es la adición de uno o más pares de bases de nucleótidos en una secuencia de ADN

Question 10

c). Grandes deleciones o borraduras

Answer 10

-Eliminación de gran número de nucleótidos
-Mutación irreversible e inactivadora de uno o varios genes

Mutación pleiotrópica - por formacion de bucles intracatenarios

Question 11

transposon

Answer 11

es una secuencia de ADN que puede moverse de manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula

Question 12

modo de accion de transposon

Answer 12

Transposón simple, secuencia de inserción o elemento de inserción (IS):

contienen una secuencia central con información para la transposasa, una enzima necesaria para la transposición, y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso. Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del ADN aparece una repetición directa de la secuencia diana

Las secuencias de inserción y los transposones originan mutaciones.
-Inactivación del gen debida a desplazamientos de la pauta de lectura.

Question 13

Otras

Answer 13

1. inversiones - trocar nucleotido a-b
2. duplicaciones en tandem -adicionan parte del gene 2 vezes
   ab-> abab

Question 14

Mutaciones inducidas y agentes mutagénicos

Answer 14

*Son mutaciones provocadas experimentalmente. *Para obtenerlas se utiliza un agente (a. mutagénico)
que produce un daño en el DNA o inhibe su replicación
*Aumentan la tasa global de mutaciones y afectan a cualquier gen.

Question 15

Agentes mutagénicos

Answer 15

1AGENTES FÍSICOS *Radiaciones
2-AGENTES QUÍMICOS
*Analogos de bases 5-bromouracilo
*Agentes modificadores del ADN o agentes alquilantes: Nitrosoguanidina
*Agentes intercalantes Bromuro de etidio

Question 16

La luz ultravioleta (UV)

Answer 16

-Produce dímeros de timina
No se puede sintetizar
la banda complementaria porque timina forman un dimero y reagen entre ellas
- agente fisicos

Question 17

Análogos de las bases

Answer 17

-Se incorporan durante la replicación del ADN
- 5 bromouracil , thymine

Question 18

Agentes modificadores de bases
Nitrosoguanidina

Answer 18

-la guanina normal Se aparea con la citosina
-pero quando se Introducen radicales alquílicos en las cadenas del ADN - nitrosoguanidina
la Nitrosoguanidina Se aparea con la timina

Question 19

Agentes intercalantes

Answer 19

Se introducen en la doble hélice del ADN. Ej. Bromuro de etidio
Durante la replicación, esta conformación anormal puede conducir a inserciones o deleciones en el ADN, originando mutaciones por corrimiento de lectura.

Question 20

Reversibilidad de las mutaciones bacterianas **

Answer 20

-Se debe a una segunda mutación que restaura el fenotipo original.

-Puede ser de dos tipos:
1. reversion
2. supresion

Question 21

reversion

Answer 21

Reversión: la 2a mutación restaura el genotipo original.

ATT——-ATA——ATT
Salvaje Mutante Revertiente

Question 22

supresion

Answer 22

Supresión: la 2a mutación suprime los efectos de la primera (restaura el fenotipo) pero no restaura el genotipo original.
ATT———ATA————ATC
Salvaje
(histidina)
Mutante
(lisina)
Revertiente
(metionina, pero el enzima igual actividad)

Question 23

1.6. Métodos de detección de mutantes

Answer 23

1. -Método de selección en placa
2. -Método de la réplica en placa

Question 24

-Método de selección en placa

Answer 24

El medio contiene una sustancia que permite la selección del mutante.
Ej. Obtención de un mutante resistente a un antibiótico.

ex: Colonia originada por una bacteria resistente a penicilina
Medio de cultivo + penicilina

Question 25

-Método de la réplica en placa

Answer 25

-Búsqueda de mutantes auxótrofos. Ej. Obtención de mutantes his-
Microorganismo que ha desarrollado un requerimiento nutricional como resultado de una mutación. El fenotipo original, que no muestra ese requerimiento, se llama prototrofo.

• se utilisa esto para ver en un cultivo normal cuantas colonias son mutantes
• el medio minimo - no tiene el nuevo requerimiento de los mutantes pero el medio completo tiene

Question 26

1.7. Las bacterias como
indicadores de sustancias carcinogénicas.
Test de Ames

Answer 26

Aproximadamente el 90% de las sustancias mutagénicas son cancerígenas.

-Se utiliza: Salmonella typhimuriun
his- sembrada en medio mínimo

-Se compara el número de colonias en un medio con un disco impregnado con a sustancia que se está investigando (provoca la reversión auxótrofa a prototrofa)

Question 27

test de ames

Answer 27

El test de Ames es un ensayo biológico ampliamente utilizado en el campo de la medicina y la investigación científica para evaluar la capacidad mutagénica de diferentes sustancias químicas. Desarrollado en la década de 1970 por el científico estadounidense y Premio Nobel Bruce N. Ames, esta prueba permite identificar compuestos que pueden causar mutaciones genéticas y, por lo tanto, tienen el potencial de ser carcinogénicos o teratogénicos en seres humanos.

El test de Ames se basa en la utilización de cepas mutantes de la bacteria Salmonella typhimurium que son deficientes en su capacidad para sintetizar el aminoácido histidina debido a mutaciones puntuales en genes específicos. Estas cepas bacterianas, denominadas his-, requieren histidina en el medio de cultivo para poder crecer y replicarse. En condiciones normales, estas cepas no pueden crecer en un medio sin histidina; sin embargo, si se les expone a un compuesto mutagénico, pueden revertir a su fenotipo salvaje, adquiriendo la capacidad de sintetizar histidina y crecer en un medio sin este aminoácido.

El test de Ames se lleva a cabo mezclando las cepas bacterianas his- con diferentes concentraciones de la sustancia química en estudio, y luego cultivándolas en un medio sin histidina. Si la sustancia es mutagénica, provocará mutaciones de reversión en las bacterias, permitiéndoles sintetizar histidina y formar colonias en el medio de cultivo. La cantidad de colonias observadas en las placas de cultivo es directamente proporcional al potencial mutagénico de la sustancia en cuestión.

Question 28

test de ames sumario

Answer 28

las mutantes son sembradas en diferentes concentraciones de la subtancia mutagena

la colonia que forma la mutacion 1 - no tiene capacidad de sintetisar histidina ( empezamos con ella - auxotrofas) -> his

una vez metida en diff conc de mutageno todas son sembradas en un medio minino que no contiene la histidina

• dependiendo de la conc del mutageno hara mas o menios crescimiento de las colonias y determinamos la formacion de colonias prototrofas capazes de sintetizar hoistidina

Question 29

Recombinación

Answer 29

Dos elementos genéticos procedentes de dos
genomas independientes se unen en uno solo.

-Normalmente implica mayor cambio genético que la mutación.

Question 30

Tipos:

Answer 30

1. Generalizada u homóloga:
   2.Específica de sitio: entre secuencias idénticas y en zonas concretas de ambos ADN.

-Ilegítima o transposición: Secuencias de inserción y de transposones. Un gen cambia de lugar en el genoma. No existe homología. No depende de la proteína RecA.

Question 31

Generalizada u homóloga

Answer 31

entre secuencias homólogas pero no idénticas; puede darse en cualquier gen. Depende de la proteína RecA.

Question 32

Específica de sitio

Answer 32

entre secuencias idénticas y en zonas concretas de ambos ADN.

Question 33

Ilegítima o transposición

Answer 33

Secuencias de inserción y de transposones.
Un gen cambia de lugar en el genoma.
No existe homología.
No depende de la proteína RecA.

Question 34

Recombinación generalizada u homóloga *

Answer 34

-Entre secuencias homólogas pero no idénticas; puede darse en cualquier gen.
Depende de la proteína RecA.

1° rotura de ADN :
primero hay un alineamiento de los dos ADN y son separados por una nucleasa
en seguida el enzima helicasa crea una muesca (hueco) en el ADN donor que se va quedar abierta por las proteinas de union a cadena sencilla

2° invasion de banda
en seguida la proteina Rec A
se encarga de transportar y unir a esta hebra de ADN con una secuencia homóloga en la otra molécula de doble hebra para así realizar el intercambio y forma el bucle D

bucle D
Estructura generada cuando una hebra adicional de DNA se une a la doble hélice, de modo que una hebra de la hélice original queda desplazada, formando un bucle con forma de D. Esta estructura puede formarse al comienzo de la replicación o durante la recombinación genética.
-
3. Rotura del bucle y formación estructura Holliday
en seguida la banda de ADN forma un enlance con la otra banda y causa una rotura del bucle y formacion de la estructura holliday - con forma de x

4° cortes con endonucleasas y resulucion
las endonucleasas realisan los cortes de las dos bandas y pueden formar dos resoluciones
(2.4B pg 3)
1- estructura de parche
corte realisado en cada axe de cada banda formando un intercambio completo de las bandas
2- structura en cremallera
corte realisado de forma vertical en el x resulta enb transferencia de mitad de cada banda

5° las ligasa y polimerasas y forman la banda de ADN

Question 35

Recombinación específica de sitio

Answer 35

Entre secuencias idénticas y en zonas concretas de ambos ADN (sitios de fijación “att”).
- No interviene RecA.

se realia entre un bacteriófago lambda (λ)
y una bacteria Escherichia coli
el bacteriofago transcreve su ADN en la bacteria para que utilise sus celulas para se reproducir y producir nutrientes causa enfermedades en las celulas de la bacteria.

1°- una vez que el ADN bdel bacteriofago atravesa la MP el genoma se circulariza y se une en los extremos formando en ponto cos(cohesivos)

2° - en seguida en el ADN de E. coli las regiones att son cortadas por las integrasas en lugares identicos y en el ADN del bacteriotrofago tambien y se unen en el medio del ADN encontramos los lugares cos (que uniran el ADN para poder unirse de manera =)

Question 36

reversion de recombinacion de sitio especifico

Answer 36

bacteria lisogenica- Estado en el que un fago con genoma DNA mantiene una relación latente o persistente, no lítica, con la bacteria hospedadora. Durante el estado lisogénico el fago no se replica, sino que el genoma viral está integrado en el cromosoma de la bacteria (ver profago) y se transmite en forma de profago a las células descendientes durante la división de la bacteria. La inserción del profago puede ocurrir en regiones concretas del DNA del hospedador o en cualquier lugar.

quando la bacteria se divide se forma en profago( el ADN del virus entegrado en la bacteria hospede)
en la bacteria hija pero en caso de cambio en condiciones externas
causa el ciclo litico - donde cambia funciones de la celula - causa multiplicacion del ADN , consome mayoria del ATP para sus acciones y formando los componentes celulares para formar mas virus alen desto tambien destroye el ADN de la celula

Question 37

Recombinación ilegítima o Transposición

Answer 37

-Proceso por el cual un gen se mueve de un lugar a otro del genoma.
-Intervienen: secuencias de inserción y de transposones. No existe homología. No depende de la proteína Rec A

Los elementos genéticos transponibles “saltan” de un lugar a otro de los genomas por un mecanismo de recombinación no homóloga “ilegítima”, es decir, que no depende de homologías entre el elemento y la zona de genomio a la que este elemento va a transponerse (esta última se suele denominar secuencia diana).
Enzima transposasa: responsable de todas las reacciones de la transposición.

-Las secuencias IS y los transposones saltan de un lugar a otro del genoma (transposición). Originan frecuentemente mutaciones.

Question 38

processo de recombinacion ilegitima o transposicion

Answer 38

En general, las enzimas que catalizan ese proceso se denominan transposasas. La transposasa corta el ADN “donador” en los extremos del elemento transponible, y luego los inserta en el ADN diana,

Todos los elementos genéticos transponibles poseen terminales inversamente repetidos (IR), es decir, la secuencia de un extremo en una cadena, leída en sentido 5’à3’ es idéntica (o casi) a la secuencia del otro extremo de la otra cadena, también leída en su sentido 5’à3’.

Secuencias de inserción (IS):
Son elementos pequeños (del orden de 1000 pb., o menos), dotadas en sus extremos de terminales inversamente repetidos (IR), de unos 15 a 25 pb.
bullet
Normalmente sólo poseen un gen, que codifica la transposasa. Por lo tanto, a diferencia de los transposones, no confieren fenotipo seleccionable.

Transposones (Tn):
Son elementos de mayor tamaño que los IS (desde casi 3.000 pb hasta más de 20.000 pb). Poseen al menos un gen para la transposasa y un gen responsable de alguna función no relacionada con la transposición: concretamente, muchos transposones portan genes cuya expresión da fenotipos fácilmente seleccionables o detectables (p. ej.: resistencia a antibióticos o a metales pesados).

Las transposasas reconocen los terminales inversamente repetidos del transposón, y cortan en los extremos (en este sentido se dice que la transposición es específica, pero sólo respecto de las secuencias del elemento transponible).
bullet
Por otro lado, las transposasas cortan también en una secuencia diana más o menos aleatoria del sitio a donde se van a transponer (inespecificidad respecto del “endogenote”, por lo que se llama a esta recombinación “ilegítima”). Los cortes son en ambas cadenas, pero en situaciones ligeramente separadas entre sí en las dos cadenas. Posteriormente hay empalmes entre las cadenas cortadas del Tn y de la diana.

Originan frecuentemente mutaciones, inactivación insercional de un gen, provoca grandes delecciones

Question 39

summary of all recombiaciones

Answer 39

https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm#_Toc64553403

Question 40

differencias de cada una

Answer 40

En bacterias encontramos los siguientes tipos principales de recombinación:

1) Recombinación general u homóloga

2) Recombinación específica (no-homóloga), en la que a su vez distinguimos:

a) Rec. específica legítima, conservativa;

b) Rec. específica “ilegítima”, propiciada por elementos genéticos transponibles.

        A continuación, y antes de abordar cada tipo de recombinación, daremos las definiciones generales de cada uno de estos procesos recombinativos:

Recombinación general u homóloga

Puede ocurrir en cualquier lugar del genomio, por emparejamiento entre pares de secuencias que presenten una homología suficientemente extensa.
bullet
Depende de la intervención de un equipo enzimático característico, en el que la proteína RecA (o equivalente) es central en el proceso.
Recombinación específica legítima (conservativa)

Requiere cortas secuencias de homología entre el exogenote y el endogenote (por eso se llama también “específica de sitio”), que son reconocidas por proteínas específicas.
bullet
Es independiente de RecA.
bullet
Este tipo de recombinación es típica de la integración de genomios de fagos en sitios concretos del genomio de bacterias hospedadoras.
Recombinación específica ilegítima: fenómenos de transposición

No depende de homologías (ni siquiera cortas) entre el exogenote (en este caso, un elemento genético transponible, como IS o Tn) y el endogenote.
bullet
También es independiente de RecA.
bullet
El elemento transponible codifica una enzima (genéricamente se les denomina transposasas) que reconoce secuencias específicas inversamente repetidas en los extremos del propio elemento, lo cual se requiere para el proceso de transposición.
bullet
Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismo replicativo de transposición: es decir, al transponerse dejan una copia de sí mismos en el sitio original, y generan una copia nueva en el sitio a donde se transponen (recombinación específica duplicativa).

Question 41

Sistema de restricción-modificación

Answer 41

Limita la transferencia de material genético
-Barrera frente ADN extraño

si el exogenote es un replicón funcional (que posee un origen de replicación capaz de ser reconocido por la maquinaria replicativa de la célula receptora), este exogenote permanece como tal replicón en estado autónomo (por ejemplo, plásmidos).
bullet
El exogenote puede recombinarse con el endogote, mediante algunos de los procesos recombinativos descritos en la primera parte de este tema.
bullet
Pero el exogenote puede sufrir otra alternativa: puede ser reconocido como “extraño” por parte de la célula hospedadora, por medio de un fenómeno enzimático llamado restricción, que conduce a la destrucción de este exogenote. Este va a ser el objeto de estudio de esta sección del tema.
La restricción es un sistema que poseen muchas cepas bacterianas, y representa una especie de “barrera” frente a la permanencia de ADN extraño que hubiera podido entrar por alguno de los sistemas que estudiaremos en los capítulos siguientes. De esta forma, las bacterias evitan la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. El posible significado adaptativo de este tipo de sistemas es el de conferir “inmunidad” frente a exogenotes (por ejemplo, fagos) que pudieran poner en peligro la individualidad genética e incluso la superviviencia de la bacteria en cuestión.

        La restricción va asociada a un sistema “paralelo” de salvaguardia del ADN de la bacteria frente al propio sistema de restricción. Este sistema de protección del ADN propio se denomina modificación, y mediante él, el ADN queda “marcado” químicamente por metilación de determinadas secuencias.

-Endonucleasas de restricción, restrictasas o enzimas de restricción
(destruyen el ADN extraño)
-descubierto en 1968 arber
-Reconocen secuencias específicas y simétricas y cortan ambas cadenas

Cada cepa posee una actividad endonucleasa que reconoce como extraño al ADN del fago crecido en la otra, y lo destruye. A este tipo de endonucleasas se las denomina endonucleasas de restricción, o más abreviadamente, restrictasas.
bullet
Con baja frecuencia, el ADN de un fago puede “escapar” a la restricción de la cepa opuesta a donde ha crecido. Una vez que ha escapado, este ADN es reconocido como “propio” por parte de esta cepa, de modo que este fago podrá crecer con total eficiencia (100%) en dicha cepa. La razón es que el ADN es modificado químicamente por el hospedador, de modo que queda protegido de la correspondiente restrictasa de esa misma cepa. La modificación química consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.
Se han descrito varios tipos distintos de sistemas de modificación-restricción (M-R), según sus mecanismos de acción generales, pero nosotros sólo trataremos los dos mejor concocidos: M-R tipo I, tipo II.

-Las enzimas de restricción de tipo II son herramientas básicas en ingeniería genética.

-Enzimas de modificación:
-La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro de la secuencia reconocida.
- metilan el DNA propio para que no sufra el efecto de las endonucleasas de restricción.

-Función del sistema de restricción-modificación: eliminar ADN extraño.
protege contra infeccion de fagos

Question 42

mecanismo de restriccion - modificacion Tipo I

Answer 42

• Reconocen un sitio específico y cortan en puntos próximos a la secuencia.

Reconocen secuencias relativamente grandes, que no presentan simetrías.
bullet
La actividad endonucleasa (de las subunidades R) no corta dentro de la secuencia reconocida, sino lejos de ella, a distancias variables (del orden de unos 1000 pb., y en lugares inespecíficos.

Question 43

mecanismo de restriccion - modificacion Tipo II

Answer 43

Reconocen secuencias específicas y cortan dentro de estas secuencias.
Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.
bullet
La secuencia reconocida consiste siempre en un corto número de pares de bases.

La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente. Muchas restrictasas cortan dentro de la secuencia, dejando extremos protuberantes mutuamente cohesivos,

Question 44

3. Mecanismos de transferencia de material genético

Answer 44

3.1. Transformación
3.2 Conjugación
3.3 Transducción

Question 45

3.1. Transformación

Answer 45

3.1. Transformación

Captación por una célula receptora de ADN procedente de la lisis de una célula donadora y que se encuentra en el medio que rodea dicha célula.

Question 46

explicacion

Answer 46

-Descubrimiento del proceso de transformación (Fred Griffith, 1928)
-Se utilizan dos cepas de Streptococcus pneumoniae.

-> cepas S (lisas, capsuladas y virulentas) y R (rugosas, no capsuladas y avirulentas), inoculadas en ratones:

1.cepas S vivas inoculadas en ratones - ratón muere

2.cepas R vivas inoculadas en ratones - ratón vive

3.cepas S muertas por calor - ratón vive
4.cepas S muertas por calor + R vivas -> ratón muere. La autopsia revela la presencia de neumococos vivos virulentos (tipo S)

La transformación fue el primer proceso de transferencia genética que se describió en los procariotas, y este hallazgo constituyó la base para suministrar el primer dato incontrovertible acerca de la naturaleza química del material genético: a partir de 1944 empezó a quedar claro que era el ADN el portador de la información genética de los seres vivos.

el equipo formado por Avery, MacLeod y McCarty
-Demuestran en 1944 que la molécula transformante era el ADN.
-El ADN era la molécula que contenía y era responsable de la herencia genética.

Question 47

-Características de la transformación

Answer 47

-El fragmento de ADN donador debe tener un tamaño determinado y ser de doble cadena.
-El ADN que penetra en la célula receptora debe de recombinarse para que se transmitan las características a la descendencia.
-La célula receptora debe ser competente.

Question 48

Célula competente:

Answer 48

Presenta condiciones fisiológicas aptas para captar ADN del medio.

Laboratorio:
* Tratamiento con CaCl2 y congelación
* Electroporación

-Se utiliza mucho en Ingeniería genética

Question 49

3.2. Conjugación

Answer 49

-Transferencia de material genético entre dos bacterias vivas, donadora y receptora, a través de un contacto físico.
La célula donadora es portadora de un plásmido.

-Plásmido integrado en cromosoma (parte de ADN)
-Plásmido no integrado separado

Question 50

b) Descubrimiento de la Conjugación:

Answer 50

1.Experimento de Lederberg y Tatum (1946)

2.Experimento de Davis (1950)
-Las células necesitan contactar físicamente.

Question 51

Experimento de Lederberg y Tatum (1946)

Answer 51

-Escherichia coli K12
-El resultado se daba en presencia de DNAasa: No podía ser una transformación

dos cepas auxotrofas foram con distincos metabolismos foan sembradas en medio minimo y incubar

• capa A - met , bio-
  +thr leu
• capa B - + met , bio
• thr, leu

en las cepas ensembradas individualmente no hubo crescimiento
en las cepas sembradas en conjunto hubo crescimiento (transf de genes)

Qué proceso de transferencia genética había dado origen a los recombinantes? Se descartó que fuera por transformación:

No había recombinantes si se usaban extractos libres de una cepa y se mezclaban con células enteras de la otra cepa.
bullet
Si en el experimento original se añadía DNasa, no cambiaban los resultados.
bullet
Se vio que se necesitaban contactos directos entre las células de las dos cepas, mediante el experimento del tubo en “U” de Davis: si en cada rama de la U se coloca una cepa distinta, y ambas están separadas físicamente (en la base de la U) por un filtro con poros de tamaño inferior al del diámetro de las bacterias, no aparecían recombinantes.

En ulteriores experimentos se comprobó que existían dos tipos de cepas de cara a la producción de recombinantes:

cepas fértiles (F+): aquellas que al mezclarlas con otras, daban lugar a recombinantes;

cepas infértiles (F-).
Los cruces de tipo F+ x F– dan origen a recombinantes;

Los cruces de tipo F–x F– no dan origen a recombinantes.

Por otro lado, se observaron dos importantes propiedades de los cruces F+ x F-:

casi la totalidad de las células infértiles (F–), al final de la conjugación, adquirían la capacidad de fertilidad (se convertían en células F+);
bullet
sin embargo, los recombinantes aparecían con mucha menor frecuencia (alrededor de 10-5).

Question 52

Experimento de Davis (1950)

Answer 52

confirmo que celulas necessitan contactar fisicamente
- filtro de vidrio poroso permeteria el passage de nutrientes pero impide el contacto fisico

Question 53

Tipos de células que intervienen en la conjugación

Answer 53

F- : no fértil, no pili, receptores pili (OmpA)
F+ : fértil, plásmido F, pili, receptores tapados
Hfr : fértil, plásmido F integrado, pili, receptores tapados
F’ : fértil, plásmido F gen cromosómico, pili, receptores tapados

—(En las células F+ el factor de fertilidad F se encuentra en forma de plásmido de replicación autónoma, independiente del cromosoma. En este estado, el factor F sólo puede provocar su propia transferencia conjugativa a las células F–, de modo que éstas adquieren a su vez dicho factor F.
bullet
En una población de células F+, de vez en cuando (con una frecuencia de 10-5), el factor F interacciona con el cromosoma: se integra en él, y entonces se replica conjuntamenente con el genóforo de la bacteria (actuando, pues, como episoma). En esta situación, el factor F puede “arrastrar” al cromosoma y transferir parte de él a la célula receptora F–. Sin embargo, en esta situación el factor F no se transfiere completo a la célula receptora, razón por la cual los cruces Hfr x F– no suelen conferir el carácter F+ a los exconjugantes del receptor.
bullet
En resumen: cada cepa Hfr es clon procedente de un evento de integración del factor F en un sitio del cromosoma de E. coli. En estos clones todas las células tienen la capacidad de transferir porciones de cromosoma y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. Así pues, en un cultivo F+ normal, existe una pequeña proporción de células Hfr. Esa minoría de células Hfr son las responsables de la baja frecuencia de recombinantes que provocan los cultivos F+.)

Question 54

El plásmido F: Integración y escisión

Answer 54

Contiene información para:
-Síntesis de fimbrias (pili)
-Síntesis de proteínas para transferencia de F a la célula receptora
-Proteínas para tapar receptores de pili (proteínas de exclusión)
-Recombinación (IS) con el cromosoma

Question 55

formas de plasmidos

Answer 55

-autónomo, en las células F+;

-integrado (como episoma), en las células Hfr;

-autónomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F’ (ver el apartado sobre sexducción).

Question 56

-Integración del plásmido F en el cromosoma -> Hfr

Answer 56

Esto da como resultado la transferencia de un plásmido F + que posee genes tra que codifican solo para un pilus de conjugación y la formación de pares de apareamiento de una bacteria donante a una bacteria receptora. Una cadena del plásmido F + se rompe con una nucleasa en el origen de la secuencia de transferencia (ORit) que determina dónde en el plásmido se inicia la transferencia de ADN sirviendo como el sitio de inicio de la replicación donde las enzimas de replicación del ADN cortarán el ADN para iniciar la replicación del ADN y transferencia. La cadena mellada ingresa a la bacteria receptora mientras que la otra cadena plasmídica permanece en el donante. Cada hebra hace entonces una copia complementaria. El receptor se convierte entonces en un macho F + y puede hacer un pilus sexual

La conjugación de Hfr comienza cuando un plásmido F + con genes tra que codifican para la formación de pares de apareamiento se inserta o se integra en el cromosoma para formar una bacteria Hfr. (Un plásmido que es capaz de integrarse en el nucleoide huésped se llama episoma).

Question 57

Escisión del plásmido F

Answer 57

-Escisión de una célula Hfr dando lugar a una célula F

El plásmido al escindirse se lleva
Hfr
consigo un gen bacteriano (zona A)
-Escisión de una célula Hfr dando lugar a una célula F’

La cepa Hfr puede revertir a F+, por una escisión precisa (exacta), que implica los extremos del factor integrado (las secuencias IS que lo “emparedan”). Cada cepa Hfr concreta presenta una frecuencia característica de reversión a F+. Algunas cepas son muy inestables, de modo que revierten frecuentemente, lo que obliga a purificarlas continuamente en el laboratorio para evitar que al final se obtenga una población F+. En cambio, otras cepas son muy estables. La cepa HfrC es la más estable, de modo que raramente revierte por escisión.

        Pero también pueden ocurrir escisiones imprecisas (en las que están implicadas secuencias repetidas diferentes a las IS que flanquean al episoma), de modo que el factor F adquiere trozos de genomio bacteriano adyacentes al lugar donde estaba integrado. Estos plásmidos F autónomos que adquieren e incorporan permanentemente un trozo de genomio bacteriano, se denominan F' (F-primas)

Question 58

Etapas de la conjugación

Answer 58

1°Unión entre las células
2. Transferencia del ADN durante la conjugación

Question 59

1°Unión entre las células

Answer 59

El pili se despolimeriza y las células se acercan.

Una célula F+ contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie de una F–.

2) El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia de que se va retrayendo. En ese movimiento de retracción, la célula F– se va acercando a la F+.

3) Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas células.

4) Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la acción de los genes traN y traG del plásmido F, y de ompA de la célula F–.

5) La proteína producida por traD (localizada en ambas membranas, citoplásmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN a la célula receptora.

Question 60

Etapa 2. Transferencia del ADN durante la conjugación

Transferencia entre células F+ y F-

Answer 60

En la célula F+, una endonucleasa específica codificada por uno de los genes tra reconoce y corta en una de las cadenas de la secuencia oriT del plásmido.
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La cadena así cortada se ve desplazada por una helicasa codifica por otro gen tra del plámido.
bullet
Los productos de otros genes tra transfieren la cadena cortada al receptor. Al parecer, los extremos de esa cadena permanecen “anclados” a otra proteína Tra (es decir, durante el proceso nunca quedan extremos libres como tales).
bullet
Cuando la cadena rota ha terminado de entrar al receptor, la proteína Tra que mantenía los extremos 3’ y 5’, vuelve a unirlos (se rehace el enlace fosfodiéster).
bullet
Durante el proceso de transferencia de la cadena rota en el receptor, se están dando dos procesos de síntesis de ADN: por una lado, la cadena intacta de F del donador sirve como molde para sintetizar la correspondiente cadena complementaria (que es idéntica, claro está, a la cadena desplazada hacia el receptor); y al mismo tiempo, en el receptor, la cadena transferida, conforme va entrando, va sirviendo para sintetizar la cadena complementaria. De este modo, al final, el donador sigue siendo F+, y el receptor se ha convertido en F+.

Question 61

summary

Answer 61

La transferencia de ADN desde una célula F+ a una F– es un proceso especial de replicación asimétrica por círculo rodante.

Una de las dos cadenas parentales del plásmido F pasa a la célula receptora, replicándose en ella;
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La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto explica porqué las células F+ siguen siendo F+ tras la conjugación.
Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hélice de F desaparezca del donador para aparecer en el receptor, sino que al final, ambos miembros de la pareja poseen un plásmido F completo.

Se finaliza la transferencia DNA Separación células

Question 62

b. Transferencia entre células Hfr y F-

Answer 62

Plásmido integrado en el cromosoma
-El plásmido integrado en el cromosoma se transfiere a partir de oriT siguiendo el modelo sigma.
-A F- se transfiere parte del plásmido y un segmento del cromosoma.

Question 63

Transferencia entre células F ́ y F-

Answer 63

-Igual que F+ x F-
-Se transfieren genes cromosómicos

Question 63

Estado del ADN donador en la célula receptora

Answer 63

F+X F-→ F+o Hfr
HfrX F-→ F-
F’X F-→ F’ o Hfr

Question 64

F+X F-→ F+o Hfr

Answer 64

-El plásmido transferido puede mantenerse independiente o integrarse en el cromosoma dando lugar a una célula Hfr

Question 65

HfrX F-→ F-

Answer 65

-El ADN transferido a la célula F- se recombina con el cromosoma o es degradado

Question 66

F’X F-→ F’ o Hfr

Answer 66

-El plásmido se puede quedar independiente (F’) o se puede integrar en el cromosoma (Hfr)
-Puede haber recombinación del gen cromosómico (A x a)

Question 67

e) La conjugación en la naturaleza

Answer 67

-Habitual en todos los procariotas.
-Muy eficiente como mecanismo de transferencia genética horizontal (HfrXF-).
-Explica la difusión de caracteres (resistencia antimicrobiana) entre las bacterias.
Ej. Plásmidos R: plásmidos parecidos al F pero llevan genes de resistencia a los antimicrobianos.

Question 68

Virus bacterianos que intervienen en la transducción

Answer 68

c.1). Virus bacterianos virulentos. Ciclo lítico
2 Virus bacterianos atemperados o moderados. Ciclo lisogénico y lítico
3Transducción generalizada
4 ) Transducción especializada

Question 68

Transducción

Answer 68

Transferencia de material genético en la que el ADN es transportado desde la célula donadora a la receptora a través de un bacteriófago.

b) Descubrimiento
Norton Zinder y Joshua Lederberg (1952)

Question 68

Ciclo lítico

Answer 68

El ciclo lítico: el fago infecta a una bacteria, la secuestra para hacer un montón de fagos y luego mata a la célula al hacerla explotar (lisar).

El ciclo lítico es el método de reproducción viral, este es usualmente el principal método de duplicación viral e involucra la destrucción de células infectadas. El ciclo consta de las siguientes fases: 1. Fase de adsorción o fijación: El virus se une a la célula hospedadora de forma estable.

Question 69

Ciclo lisogénico

Answer 69

Tiene lugar cuando el ADN del bacteriófago se integra en el cromosoma bacteriano por recombinación específica de sitio.

Question 69

transduccion

Answer 69

La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:

1. Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.

Question 69

transduccion generalizada

Answer 69

La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.

Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el calificativo de generalizada).
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La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas.
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El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión.

extra info
Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

Mecanismo de la transducción generalizada promovida por el fago P22 de S. typhimurium.

1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Por encapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se “equivoca”, y en su lugar introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo lugar la infección ([1]).

        Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de ADN de Salmonella en la cápsida.

        Al final de esta fase, la célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio distinto del genomio de la bacteria.

2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener varios destinos posibles:

a) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.

b) Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general dependiente de RecA. Se produce una recombinación con dos sobrecruzamientos (“crossing-overs”), que conduce a la integración de doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga del endogenote.

c) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado; este ADN puede persistir en la célula sin replicarse. La consecuencia de esto es que cuando la célula que originalmente recibió ese ADN exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, la cual a su vez la pasará a una hija en la siguiente división, y así sucesivamente. Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon por transmisión unilinear: tras varias generaciones, el clon consta de n-1 células sin exogenote y una sola célula con ese exogenote. A este fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación (más de 90% frente a sólo 1-5%).

La célula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto, la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la siguiente generación. Las hijas de la hija (“las nietas no herederas del original”) reciben la cuarta parte, etc… es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la expresión previa de los genes del exogenote. Esto significa que las células no herederas pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote, hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.

Esto permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos, distinguiéndolos de los transductantes completos. Por ejemplo, si estamos seleccionando transductantes en base a la adquisición, por parte de una cepa receptora auxotrofa, de la versión silvestre del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con medio mínimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:

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colonias grandes, correspondientes a transductantes completos;
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microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos.
d) Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede replicarse autónomamente.

e) Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el genoma de la célula receptora.

        No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores de transducción generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen ser aquellos que no degradan totalmente el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar (de otra manera, no habría ADN intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento de ADN no debe ser muy específico: fagos como el P22 de Salmonella typhimurium o el P1 de Escherichia coli tienen un mecanismo de empaquetado secuencial de unidades de concatémeros, mecanismo que reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del hospedador.

Question 69

Transducción generalizada caracteristicas

Answer 69

-La realizan fagos con ciclo lítico (virulentos).
-La probabilidad de transferencia es igual para cualquier región del cromosoma.
-El ADN transferido puede sufrir recombinación generalizada.

Question 69

e) Transducción especializada

Answer 69

Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado l y su hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción especializada, y sus caracteres distintivos son:

sólo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de integración del ADN del fago (profago) en la célula lisogénica (p. ej., en el caso de l, los marcadores gal o bio);
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se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica, productora de nuevas partículas de fago;
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el ADN genómico de la bacteria transportado por la partícula transductora va unido a ADN del fago;
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la célula transductante se suele convertir en lisogénica para el fago correspondiente.

-La transducción no siempre va seguida de recombinación del ADN en la célula receptora.

Question 69

Características:

Answer 69

-La realizan fagos con ciclo lisogénico cuando el profago se escinde y pasa a ciclo lítico.
-Se transfieren las zonas del cromosoma próximas al lugar de integración del profago.
-El ADN transferido tiene que sufrir recombinación generalizada.