Week 3 HC 7: Promeotics, metabolomics, microRNA, siRNA Flashcards
Proteomics
Bestudeert alle eiwitten van de cel
Hoeveelheid actief eiwit is betere maat voor genexpressie van mRNA
- mRNA zorgt voor meer dan alleen eiwitsynthese
Mogelijkheden voor analyse:
- Eiwit-identificatie
- Eiwit-modificatie
- Eiwit interactie mapping
Massa spectometrie
Kan gebruikt worden voor:
- Eiwitten identificeren en kwantificeren
- Bindende eiwitten identificeren
- Eiwitmodificaties identificeren
Massaspectometer:
- Lange buis met een plaat waarop eiwit mengsel wordt aangebracht
- Op de plaat wordt met laser geschenen, waardoor eiwit positief geladen wordt en wegschieten
- Ze worden aangetrokken door negatief geladen plaat aan de andere kant waar een gat in zit
- Hier schieten ze doorheen richting de detectorplaat
- Hoe kleiner de peptide, hoe sneller hij beweegt
- Molecuulmassa en relatieve hoeveelheid kan aangeduid worden
Eiwit identificatie met massa spectometrie
Eiwit of eiwitmengsel –> in stukjes geknipt mbv protease trypsine –> analyse met massa spectrometrie –> data vergelijking met Humane Genoom Project –> Identificatie van het eiwit
Trypsine:
- Darmenzym
- Knipt de peptidebindingen van eiwitten op specifieke plaatsen: op Arginine (R) en Lysine (K) –> hierdoor peptiden die beginnen met K of R = tryptische fragmenten
- Dit mengsel van tryptische fragmenten kan onderzocht worden
Humane genoom database en massa spectrometrie data
Mengsel van eiwitten –> trypsine –> tryptische fragmenten –> massa specometrie –> molecuulmassa’s
Database menselijk genoom –> computer –> alle mogelijke eiwitten –> computer –> alle mogelijke tryptische fragmenten –> computer –> berekende molecuulmassa’s
Deze vergeleken met molecuulmassa uit spectometrie –> HIT –> eiwit geïdentificeerd
Massa spectrometrie en eiwit interacties
Maak een extract van de cellen en isoleer het eiwit of eiwit-DNA complex waarin je geinteresseerd bent
Elueer alle eiwitten die interactie hebben met die eiwit (complex)
- Dmv een antilichaam voor eiwit waarvan je interacties wil weten
Analyseer welke peptiden aanwezig zijn na het wegwassen
Alle interacties in een figuur –> meer te weten komen over complexe regulatiecircuits in cellen
Massa spectrometrie en eiwitmodificatie
Start met eiwitmengsel –> behandeld met trypsine –> Verrijk de peptiden met fosfaatgroep –> identificeer mbv massa spectrometrie
- Eerste piek is eiwit zonder fosfaatgroep
- Tweede piek is eiwit met fosfaatgroep
Metabolomics
Analyseert welke metabolieten voorkomen
Kan mogelijk gebruikt worden voor vroege detectie tumoren
Stappen:
- Sample preparation: eventueel zuiveringsstap
- Massa spectrometrie
- Identificatie mbv computer
- Herkennen van patroon
- Wat is de biomarker?
mRNA is niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)
mRNA zorgt ook voor regulatie van:
- Eiwitmodificaties
- Eiwitstabiliteit
- Translatie
MicroRNA’s en translatie regulatie
MicroRNA
- Van DNA wordt stuk RNA afgeschreven
- Drosha knipt het tot pre-miRNA
- Transport naar cytoplasma
- Dicer knipt het tot miRNA
- 1 streng wordt ingebouwd in RISC complex –> hierin binden aan complementaire sequentie in het mRNA
- miRNA zorgt voor specificiteit, eiwitcomponenten zorgen voor repressie van translatie of meer mRNA afbraak
Belang microRNA voor kanker
Bijna de helft van alle onderzoeken richt zich op kanker
Meerdere voorbeelden van directe beinvloeding van kanker-gerelateerde genen (bijvoorbeeld miRNA-16)
- miRNA-16 verlaagd
- Bcl2 verhoogd –> apoptose remming
- Cdc25A verhoogd –> celcyclus progressie
MicroRNA expressie en diagnose
MicroRNA microarrays kunnen de expressie van honderden miRs tegelijkertijd bepalen
Dit kan ook met NGS
Dit kan net als bij mRNA expressieprofielen geanalyseerd worden
Goede diagnostische en prognostische waarde
Combinatie met mRNA microarrats/ sequencing, proteomics en metabolomics geeft zeer veel info
Alle technieken duur, dus uiteindelijk zal voor een relatief goedkopen combinatie gekozen worden, nog niet duidelijk welke dat zal worden
Gebruik van korte RNAs in het onderzoek
Worden ook in RISC ingebouwd maar op andere manier ontstaan
Trigger dsRNA –> Dicer protein complex knipt het in stukken –> siRNAs –> ingebouwd in RISC –> RISC knipt dsDNA in kleinere stukken –> afbreken van mRNA
Door specifieke siRNA in cel te brengen kunnen specifieke stukken mRNA afgebroken worden
Ingrijpen in de groei van kankercellen
Geen mRNA is geen eiwit
siRNAs zorgen voor mRNA afbraak (dit wordt ook wel RNA interferentie (RNAi) genoemd)
RNAi kan voorkomen dat eiwitten die essentieel zijn voor de groei van kankercellen tot expressie komen
RNAi screens achilleshiel kankercel vinden
- siRNA voor veel genen, elk in aparte celkweek
- IN elke celkweek is nu 1 gen uitgeschakeld
- Analyseer het effect van deze behandeling
- Kijk welke siRNA’s celdood geven voor kankercellen maar geen normale cellen
- Controleer dan of er al remmers voor deze targets aanwezig zijn
- Controleer of die remmer inderdaad werkt in cellen en diermodellen
