Week 3 HC 5: Cytogenetische afwijkingen Flashcards
Cytogenetica en nut ervan
Cytogenetica
- Lokalisatie chromosomen
- Erfelijke eigenschappen celkern
- Overdracht erfelijk materiaal
Nuttig voor:
- Stellen van een diagnose
- Bepalen van prognose; verschillende translocaties etc van AML of MDS kan verschillende prognose hebben
- Respons op chemotherapie
- Identificatie van betrokken genen; Leukemogenesis en hematopoiesis –> mogelijke behandeling opties
AML- (cyto) genetische afwijkingen
50% geen afwijkingen
- Normaal karyotype
11 % complex karyotype
23% zowel chromosomale als genetische afwijkingen
Detectie en identificatie van chromosomale afwijkingen op 3 manieren
Klassieke cytogenetica
- Banderings technieken
Moleculaire cytogenetica
- Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
- Array (SNAP array)
Moleculaire diagnostiek
- RQ-PCR (fusie-genen)
- Q-PCR
- Sequencing (Sanger => Next Generation Seq)
Het verkrijgen van materiaal bij cytogenetisch onderzoek, 4 stappen
Normaal geen chromosomen zichtbaar wanneer er geen celdeling is
Stap 1: Kweken
- Beenmerg heeft voorkeur
- Groeifactoren toegevoegd
Stap 2: Stop zetten celdeling
- Met Colcemid
- Mitose blok
- Tijdens metafase bevroren
Stap 3: Hypotone oplossing toegevoegd
- Cellen gaan zwellen en kapot
- Deze kapotte cellen worden gefixeerd met methanol-azijnzuur
Stap 4: Bandering
- R-, G- of Q-bandering
- Hierna is een streepjescode te zien
Chromosomale afwijkingen
Numerieke afwijkingen:
Winst (van een compleet chromosoom)
Verlies (van een compleet chromosoom)
Structurele afwijkingen:
Gebalanceerd
- Translocatie (uitwisseling van terminaal chromosomaal segment)
- Inversie (binnenkant chromosoomarm; paracentrisch. Rond centromeer; pericentrisch)
- Insertie
Niet-gebalanceerd
- Deletie (deel van een chromosoom)
- Amplificatie (duplicatie, dmin, hsr)
- Niet-gebalanceerde translocatie
- Gen Mutatie (op niveau van baseparen)
Opbouw van chromosoom
Korte arm boven
- P-arm
Centromeer
Lange arm onder
- Q-arm
Beschrijving karyotype
45,XY,-7[10]
Chromosoom 7 in metafasen 10 mist bij een mannelijk karyotype
Er mist een chromosoom, daarom 45 ipv 46
Breukpunten voorbeeld: t(9;11)(p22;q23)
- Translocatie van chromosoom 9 en 11
- Bij chromosoom 9 zit breekpunt op P-arm plek 22
- Bij chromosoom 11 zit breekpunt op Q-arm plek 23
Slechte risico afwijkingen bij AML
Complex karyotype:
- Meerdere afwijkingen
- Slechte prognose
Monosomaal karyotype
- 2 monosomiën of 1 monosomie en een structurele afwijking
- Zeer slecht risico, Overall Survival 7%
- Slechte overleving ondanks behandeling met allogene transplantatie
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
Methode om mutaties zichtbaar te maken
Gericht op specifieke target
DNA van chromosoom uit elkaar gehaald door verwarmen
Probe
- Gebruikt om te kijken of stukje DNA aanwezig is
- Fluorescerende label wordt aan probe geplakt
2 Soorten FISH:
- Metafase bij gekweekte, delende cellen
- Interfase bij niet/slecht delende cellen (snelle analyse)
Voordelen en nadelen FISH
Voordelen:
- Detectie van microdeleties
- Breukpunt detectie en verbetering
- Detectie van cryptische translocaties en complexe genoom veranderingen
- Snelle diagnostische detectie op kernen in de interfase
- Demonstratie van een kleine hoeveelheid van afwijkende cellen
Nadelen:
- Gelimiteerde sensitiviteit
- Geeft alleen antwoord op gestelde vragen
- Beperkte target locaties om te onderzoeken
FISH; Fusie-probes en break apart probes
Fusie-probes
- Specifiek ontwikkeld om translocaties aan te tonen
- Fusie signaal is geel (groen en rood)
- Ze kunnen ook zo dicht bij elkaar zitten dat er co-lokalisaties plaats vindt = vals positiviteit
Break-apart probes
- Wanneer translocatie heeft plaatsgevonden wordt er 1 fusie, geel en rood en groen waargenomen
- Wanneer er geen translocatie; 2 geel
Problemen met Multiple Myeloom (MM)
Moeizaam chromosomen onderzoek
Laag percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat
Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities
- Normaal karyotype met afwijkende FISH op interfase kernen
Aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar
Oplossing; hoger percentage plasmacellen nodig; zuivering van de plasmacellen
Zuivering van de plasmacellen bij MM
Rode bloedcellen verwijdering met rode bloedcel lysis
Zuivering met anti-CD138 kit (Stem Cell Technologies)
SNP; Singel Nucleotide Polymorphism -array
Er wordt genoom breed gekeken
Er wordt getest of iemand voor bepaalde SNP homozygoot of heterozygoot is
Je hebt allel A en B:
- Per individu: AA, AB, BB
- Door verschillende kleuren geven, goed opsporen
Analyse wordt gedaan dmv LogR en B-allele frequency
- LogR = Maar voor aaantal kopieen dat aanwezig is
- B-allele frequency = frequentie van SNP
Wat betekend het:
- 2 Allelen aanwezig normaal (AA, AB, BB)
- 1 Allel aanwezig = deletie (A/-, B/-)
- 2 Allelen aanwezig = duplicatie (AAA, AAB, ABB, BBB)
- 2 Allelen aanwezig, maar alleen AA en BB = verlies van heterozygositeit (AA, BB)
FISH en SNP
FISH
- Geen LOH
- Wel: translocatie/ winst van chromosomen/ deleties/ gains
SNP
- Geen Translocaties
- Wel: Winst van chromosomen/ deletie/ gains/ LOH
