Week 2 HC 5: Next Generation Sequencing

Question 1

Toepassing NGS in moleculaire pathologie

Answer 1

NGS wordt gebruikt voor de detectie van:
- Kleine mutaties (vb. puntmutaties)
- Deleties en amplificaties
- Translocaties en fusiegenen
Toepassingen:
- Differentiaal diagnostiek (Diagnose A of B)
- Therapiekeuze (Therapie A of B)
- Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
- Oncogenetica (Erfelijke tumorsyndromen) ism Klinische Genetica
- Weefsel-indentificatie (Weefsel van pt A of pt B)

Question 2

Opbouw genetische informatie

Answer 2

Genetische informatie ligt opgeslagen in DNA
Ongeveer 22.000 genen
Volledig humaan genoom wordt met 3x10^9 basen beschreven
46 chromosomen
- 23 vader en 23 moeder
- 22 autosomen en 1 geslachtschromosoom
Basen:
- A-T verbonden met 2 H-bruggen
- C-G verbonden met 3 H-bruggen –> moeilijker uit elkaar te halen

Question 3

Historie DNA sequencing

Answer 3

Structuur van DNA
- 1953
- Watson en Crick
DNA sequencing
- 1977
- Sanger
DNA amplificatie (PCR)
- 1983
- Mullis

Question 4

Hoe zit PCR in elkaar? (amplificatie)

Answer 4

PCR is de vermeerdering van een klein stukje DNA
Denaturatie:
- Een dubbelstrengs DNA molecuul wordt gesplitst door temperatuurverhoging van 90-95 graden
Hybridisatie:
- Bij 50-60 graden Hecht de primer aan het template DNA
Elongatie
- Bij ongeveer 72 graden zorgt Thermus Aquaticus (Taq) polymerase voor plaatsen van nieuwe nucleotiden

Question 5

Next Generation Sequencing

Answer 5

Single Molecule
- Sequentie van afzonderlijke moleculen wordt bepaald
- En niet van een mix van verschillende moleculen
Massively Parallel
- Van een zeer groot aantal afzonderlijke moleculen de sequentie in parallel wordt bepaald
- Tegelijkertijd, in dezelfde analyse

Question 6

2 NGS-methodes

Answer 6

Amplicon enrichment
- IonTorrent
- Specifiek deel van genoom wordt gesequenced
- PCR –> Adapter ligation –> ready for sequencing
Hybridization capture
- Illumina
- DNA wordt in kleine fragmenten gesplitst
- Adapter ligation –> Capture (interessante gebieden) –> Pull down –> ready for sequencing

Question 7

Sequencing

Answer 7

Met behulp van adapters worden moleculen gebonden aan flowcell
- Hier worden DNA fragmenten geamplificeerd –> clusters
- Elke nucleotide heeft eigen kleur
Door fragmenten te vergelijken kom je erachter van welk gen het komt
DNA barcoding
- Om unieke moleculen te achterhalen

Question 8

Terminologie

Answer 8

Coverage (deep sequencing)
- Aantal malen dat een base-positie bepaald is
- Hoe hoger de coverage, hoe deeper gesequenced
Whole Genome Sequencing (WGS)
- Of Whole Exome Sequencing (WES)
- <100 maal diep
Targeted sequencing
- Honderden tot enkele duizenden fragmenten
- 500x - 10.000x deep
Variant Allel Frequentie (VAF)
- Aantal malen dat een variant op een specifieke positie gevonden is tov referentie
- Afhankelijk van Gen (oncogen vs tumor-suppressor-gen) en Tumorcelpercentage

Question 9

Samengevat oud vs nieuwe

Answer 9

Sanger sequencing
- Mix van moleculen
- 1 Fragment/ analyse
- Output max 1000 basen
- Veel DNA nodig
- Lage gevoeligheid (20%)
- Poolen niet mogelijk
- Eenvoudige analyse
Next Generation Sequencing
- Single molecule
- Duizenden fragmenten/ analyse
- Output 1-20 x10^9 basen
- Weinig DNA nodig
- Hoge gevoeligheid (1-2%)
- Poolen van samples (barcode)
- Bio-informatica vereist