Western Blotting ​

Question 1

Blotting - Significado

Answer 1

Borramento → no final obtemos um borramento (mancha).

Question 2

Blotting - Tipos 3

Answer 2

Western

Northen

Souther

Question 3

Western Blotting - Função

Answer 3

Pesquisa de Proteínas

Question 4

Western Blotting - Importância

Answer 4

Teste confirmatório de HIV → identificando as proteínas do vírus.

Question 5

Pesquisa de Proteínas - Exemplo

Answer 5

Detecção de anticorpo no soro anti-HIV (proteínas de envelope e núcleo-capsídeo) → através de Proteínas Sintéticas Comerciais (Ag)

Question 6

Soro vs Plasma 3

Answer 6

Ambos → não tem células vermelhas

Soro → não tem plaqueta (e nem agentes coagulantes)

Plasma → tem plaqueta (e agentes coagulantes)

Question 7

Anticorpo - O que fazemos com eles? 2

Answer 7

Anticorpo → presente no soro

Anticorpo → colocado sobre as proteínas virais

Question 8

Proteínas Girais - Origem 1/3

Answer 8

Comercial:

→ p24 → nucleocapsídeo

→ gp41 → envelope

→ gp120 → envelope

Question 9

Western Blotting - Processo 5

Answer 9

Proteínas do vírus → são dissociadas em SDS

Separação dos AG → através de eletroforese em gel de Poliacrilamida (SDS-Page)

Ag → são eletrotransferidos do gel → para a membrana de nitrocellulose (como se fosse um carimbo)

Gel → guardado

Uma vez na membrana → incubamos os anticorpos do paciente → Ag reagirão com os Ac presentes no soro do paciente

Question 10

Anticorpos - Tipos 2

Answer 10

Primário

Secundário

Question 11

Anticorpos - Processo 3

Answer 11

Primário → que se liga na membrana de nitrocellulose no antígeno do HIV

Secundário → específico para o anticorpo primário

Entre uma etapa e a outra → lavagem

Question 12

Lavagem - Importância

Answer 12

Membrana → deve ser lavada → porque os anticorpos primários irão ter se ligado inespecificamente por toda a membrana → e queremos observar somente as regiões onde estão ligados especificamente ao antígeno viral

Question 13

Anticorpos - Origem

Primário → ?

Secundário → ?

Answer 13

Anticorpos - Origem

Primário → soro do paciente

Secundário → comprado / marcado com fluorescência

Question 14

Fluorescência - Visualização 3

Answer 14

Uma vez incubado → vamos para a sala escura

Sala escura → luz vermelha → onde ocorre revelação de filme

Indução da fluorescência → enzima reveladora

Question 15

Fluorescência - Enzima Reveladora

Answer 15

Peroxidase

Question 16

Fluorescência - Descrição do que ocorre:

Answer 16

Onde houver fluorescência devido à reação antígeno anticorpo → o filme radiográfico → queima → e fica escuro.

Question 17

Western Blotting - Passo-a-passo: 8

Answer 17

Amostras de Antígenos

SDS-Page → Gel de Poliacrilamida

Membrana de Nitrocelulose

Incubação da Membrana de Nitrocelulose + Plasma (Antígeno Primário)

Lavagem

Adição do Antígeno Secundário

Tratamento Enzimatico → Peroxidase

Revelação → Fluorescência
​