Vetores - YAC Flashcards
YAC - Yeast
Leveduras
YAC - Levedura
Saccharomyces cerevisiae
YAC - Clonar inserto de até:
1~2mb / 1~2 milhões pb
YAC - Se você for usar um BAC, que suporta até 300 mil, temos que usar o YAC, mas é se não tivermos?
Podemos utilizar vários BACs ou até mesmo outros tipos.
YAC - Composição 3
Centrômero → CEN
Telômero → TEL
Sequência de Replicação Autônoma de Leveduras → ARS
YAC - Região Centromérica → Importante para:
Vetor → permanecer de forma única dentro da célula → dando estabilidade na replicação → para que cada célula filha receba o YAC.
YAC - Telômeros → Função 2
Impede o encurtamento
Proteger da degradação → enzima BamHI
YAC - ARS
Origem de replicação
YAC - Levedura → O que é?
Eucarioto Inferior
Levedura - Importância 2
Proteínas → bastante semelhança com as de células de mamíferos → também com semelhança na funcionalidade.
Podemos utilizar leveduras para estudar células de mamíferos → porque células de mamíferos são muito caras para serem utilizadas diretamente.
YAC - Vantagens
Podem ser clonados → genes humanos inteiros
YAC - Desvantagens
Estabilidade → são menos estáveis que BAC
YAC - Desvantagens → Devido ao tamanho do vetor:
Podem perder ele.
YAC - Métodos de Seleção 2
URA3 → uracila
TRP1 → triptofano
Levedura - Naturalmente
Não produz triptofano e nem uracila → devemos adicionar artificialmente.
YAC - Quem recebe o vetor:
Irão conseguir produzir uracila e triptofano → e isso nos permite selecionar as células.
YAC - Marcas de Seleção 2
Triptofano / Uracila → estratégia que o vetor da para a célula produzir ambos
AMP^r
AMP - Colocada no meio
Cultura que cresceu no meio → irá ter resistência ao ATB.
YAC - Enzimas de Restrição 2
BamHI → Linearização
EcoRI → Inserto
YAC - As sequências TRP1 e URA3 codificam genes marcadores de seleção, permitindo:
Um fácil isolamento das leveduras que apresentarem o cromossomo.
YAC - Comportam-se como:
Cromossomos → moléculas lineares.
YAC - Cópias por célula:
1
YAC - Processo
Cortamos o vetor com EcoRI → colocamos o inserto → adicionamos DNAlig → obtendo o vetor linearizado.
Então tratamos com Bam HI → cortando o vetor novamente em outro ponto → obtendo um vetor linearizados.
YAC - Ao colocar o vetor linearizado na célula:
Corremos o risco das nucleares degradarem o vetor.
YAC - Como corremos o risco das nucleases degradem o vetor:
Colocamos esperma de salmão → que se liga à região → protegendo as extremidades teloméricas da degradação.
Esperma de Salmão - Importância
Se não adicionarmos o esperma de salmão → teremos uma baixa eficiência de clonagem.
