Endocrinologie - Cours 12 Méthodes de dosage Flashcards
Quelle est la définition typique des hormones?
Substances produites par les glandes endocrines, relâchées dans le sang et transportées vers les tissus où elles exercent une action régulatrice de certaines fonctions spécifiques
Nommer les différentes familles d’hormones selon leur nature chimique
- Protéines et peptides
- Stéroïdes et dérivés
- Autres
- Dérivés d’acides aminés..
- Dérivés d’acides nucléiques
Nommer des hormones dosées au laboratoire (peptide ou protéine)
- ACTH
- hCG
- FSH, LH, TSH
- Insuline, peptide C, IGF-I
- PTH
- Glucagon, gastrine
- Calcitonine
Nommer des hormones dosées au laboratoire (stéroïdes et dérivés)
- Cortisol, DHEA, DHEAS
- Testostérone, Estradiol
- Progestérone
- Androstènedione
- Vitamine D
Nommer des hormones dosées au laboratoire (autre dérivé)
- Dérivés d’acides aminés : T3, T4, catécholamines, sérotonine
- Dérivés de nucléotides : AMPc
Vrai ou faux : Les petits peptides (Ex : ADH) ont tendance à être plus stables que les grosses protéines (Ex : hCG)
FAUX
Les petits peptides ont plus tendance à être facilement dégradés; plus instables
Compléter la phrase :
Les stéroïdes sont des molécules qui partagent tous le même squelette de base : __________
Les stéroïdes sont des molécules qui partagent tous le même squelette de base : le noyau stérol
Vrai ou faux : La vitamine D est dérivée du cholestérol
VRAI
Quelles propriétés des hormones peuvent jouer sur la capacité de la méthode de dosage à doser la molécule en question?
- Poids moléculaire
- Variations et transformations de structure :
- Formes atypiques (mutées)
- Modifications post-traductionnelles
- Glycosylation, phosphorylation
- Prépro et prohormones
- Disproportion des SU
- Dimères, macro-hormones
- Formes partiellement métabolisées (oxydée)
- Formes conjuguées
- Formes libres ou liées à des protéines
**Quelles formes sont pertinentes à mesurer? Sont-elles reconnues par la méthode ou pas? Utilité clinique/interférence?
Nommer des considérations cliniques à prendre en considération pour le dosage des hormones (et nommer un exemple pour chacun
- Sexe (testo)
- Âge :
- Période de croissance rapide (GH)
- Évolution puberté (GH)
- Ménopause, andropause (testostérone)
- Cycle circadien : heure de prélèvement (cortisol)
- Cycle menstruel (progestérone)
- Ovulation (LH)
- Grossesse (hCG)
- Allaitement (prolactine)
- Niveau de stress (cortisol, prolactine)
- Aliments
- À jeun (ghréline, CCK, somatostatine)
- Restrictions alimentaires à considérer
- Médicaments : impact physiologique sur sécrétion hormonale (pillule contraceptive)
Nommer 3 Rx qui peuvent causer une hyperprolactinémie
- Estrogènes
- Antidépresseurs (antidép tricycliques)
- Antipsychotiques (thioxanthène)
Discuter des généralités à propos de la fraction libre et liée des peptides hormones
Petites hormones (stéroïdes et thyroïdiennes) avec transporteurs
- Activité biologique proportionnelle à la concentration de l’hormone libre dans le sang
- Influence de la fonction hépatique sur la synthèse des transporteurs et sur la concentration de l’hormone totale en circulation
- Demie vie plus longue des fractions liées
- Fraction biodisponible = fraction libre + fraction liée faiblement à des protéines
- t 1/2 de dissociation relativement courte
Nommer différents milieux de dosage des hormones
- Prélèvement sanguin (plasma, sérum, sang total)
- Urine (collecte 24h ou miction)
- Autres liquides
- Salive
Pourquoi certaines hormones sont prélevées sur tube lavande EDTA?
EDTA principalement pour inhiber les protéases
- Dosage des hormones plus fragiles
- Tube peut être prérefroidit avant le prélèvement
- Tube conservé sur glace et centrifugé sans délais (< 30 mins)
- Au besoin ajouter un inhibiteur de protéases (aprotinine)
Nommer différents sites de prélèvement sanguin
- Veine périphérique
- Cathétérisme sélectif : site de prélèvement très près de la glande endocrine
- Ex : sinus pétreux ACTH pour
Compléter la phrase :
De façon générale, le dosage d’une hormone sur une miction est un test _________ alors qu’un dosage sur une collecte 24h est un test __________
De façon générale, le dosage d’une hormone sur une miction est un test qualitatif** alors qu’un dosage sur une collecte 24h est un test **quantitatif
Quelles sont les préoccupations à avoir au sujet des prélèvements urinaires pour s’assurer de l’exactitude des dosages?
Surveiller la température et les agents de conservation
Quelles sont les caractéristiques associées à un dosage de salive?
- Prélèvement facile et non invasif
- Reflet de l’hormone libre dans le sang
- Exige une méthode plus sensible car faibles concentrations
Quelle est la définition d’un immunoessais?
Technique où des anticorps sont utilisés comme réactifs pour identifier ou quantifier un constituant présent dans un liquide biologique
Discuter de la considération de la taille des molécules pour les essais immunologiques
Grosseur de la molécule teinte le type de méthode immunologique à utiliser
- Très petites molécules (Ex: catécholamines)
- Essais non-immunologique
- Petites molécules (Ex : stéroïdes, T4/T3, ADH, Vit D)
- Essais non-immunologique
- Essais immunologique à 1 Ab (compétitif)
- Grosses molécules (Ex : hCG, prolactine, insuline, ACTH, PTH, TSH)
- Essais immunologique de type compétitif (1 Ab)
- Essais immunométrique (2 Ab)
- Très grosses molécules (Ex : IgM, IgG)
- Néphélométrie
- Turbidimétrie
Qu’est-ce que l’affinité de l’anticorps?
L’affinité c’est la mesure de la force d’attraction de l’Ab pour l’Ag.
- Plus la constante d’affinité (Ka) est élevée, plus l’Ab a de l’affinité pour l’Ag, plus il se lie complètement et rapidement et moins il permet la liaison avec d’autres Ag ou protéines
Vrai ou faux : Lorsque l’affinité de l’anticorps est grande, la sensibilité et la spécificité de l’immunoessai s’améliorent et les effets matrice sont moindres
VRAI
Dans les immunoessais, de quelle façon la formation de la composante Ab-Ag peut être quantifiée?
- En mesurant la lumière dispersée ou absorbée
- Néphélémétrie, turbidimétrie
- En mesurant le signal produit par un maruquer fixé sur l’Ag ou l’Ab
- Immunoessais avec marqueur
- En visualisant la précipitation du complexe immun formé
- Immunodiffusion double ou radiale
- Électroimmunoessais
Compléter la phrase :
En néphélémétrie, on mesure la lumière ___________ alors qu’en turbidimétrie on mesure la lumière ___________
En néphélémétrie, on mesure la lumière dispersés** alors qu’en turbidimétrie on mesure la lumière **absorbée
Sur un Ab, comment appelle-t-on la partie appartenant à une espèce animale et la partie contenant les sites de liaison à l’Ag?
Fc : Espèce animale
Fab : site de liaison à l’Ag
Décrire les caractéristiques d’un immunoessais compétitif
- Sensibilité dépend grandement de l’affinité de l’Ab
- Ab en concentration fixe et limitante
- Ag marqué en concentration fixe
- Ag* et Ag doivent saturer les sites sur les Ab
- Ab avec la même affinité pour Ag* et Ag
- Élimintation des composantes libres
- Mesure de Ab-Ag*
- Signal inversement proportionnel à la concentration de l’Ag à doser
- IE peut être en 1 ou 2 étapes :
- One step : Ag* et Ag ajoutés en même temps. Méthode hétérogène. Capable d’éliminer ce qui est libre
- Two step : Ag incubé avec Ab en 1er. Ag* ajouté en excès ensuite et liaison aux sites de liaison résiduels
Quelle est la plus grande limite des immunoessais compétitifs?
Coube de signal sigmoïdale et fenêtre dynamique de mesure restreinte
- Couvre une échelle de concentration relativement petite
- Déterminant dans le développement de la méthode
- On doit être suffisamment sensible, sans devoir faire constamment des dilutions
Quels sont les avantages des immunoessais compétitifs?
- Seule approche immunologique valide pour certaines molécules < 3000 daltons
- Pas d’effet crochet
Quelles sont les limites/inconvénients des immunoessais compétitifs?
- Sensibilité affinité-dépendante
- Liaison du marqueur à l’Ag peut modifier et réduire sa capacité de liaison
- Signal vs concentration est peu linéaire
- S’améliore un peu avec saturation séquentielle (two step)
- Ne pas diluer
- Spécificité limitée et moins grande que les essais immunométriques pour les hormones protéiques
Pour quelles molécules utilise-t-on surtout les immunoessais compétitifs?
- Hormones thyroïdiennes totales
- Hormones thyroïdiennes libres
- Stéroïdes
- Vitamine D
- Autres petites molécules
- Polypeptides et protéines
Quelle sont les caractéristiques d’un essais immonométrique (sandwich)?
- 2 Ab d’affinité peu élevée contre des épitopes différents sur l’Ag à doser
- Ab capteur : Ab lié à un support solide
- Ab* : Ab lié à un marqueur (signal)
- Lavage pour élimitation des Ab* libres
- Mesure des complexes Ab-Ag-Ab*
- Signal directement proportionnel à la concentration à doser
*Possible d’utiliser 3 Ab. le 3e Ab serait marqué et pourrait reconnaitre Ab 2°
Quels sont les avantages d’une méthode immunométrique (2 Ab)?
- Plus sensible que l’immunoessai compétitif
- Liaison du marqueur * n’affecte pas la stabilité de l’Ab
- Utilisation de 2 Ab augmente la spécificité de la méthode pour l’Ag à doser
- Relation nettement plus linéaire entre le signal et la concentration de l’Ag à doser
Quelles sont les limites/inconvénients des méthodes immunométriques (2 Ab)?
- Exige l’utilisation de 2 Ab dirigés contre 2 épitopes antigéniques distincts
- Méthode limitée à la mesure des protéines > 3000 Da
- Sujet à l’effet crochet
***Qu’est-ce que l’effet crochet?
- Effet observé dans les essais immunométriques lorsque la concentration de l’Ag est trop élevée p/r à celle des Ab
- Les Ab sont saturés par les Ag.
- Empêche formation du sandwich
- Les Ag en excès ne sont pas captés par les 2 Ab et le signal plafonne ou s’abaisse de manière paradoxale
- Résultat sous-estimé
- Donne des résultats paradoxalement normaux ou légèrement élevés en présence de concentration très élevées d’Ag
Dans quel contexte rencontre-t-on généralement l’effet crochet?
- Tumeur sécrétante : prolactine, hCG, FSH, LH
- Cathétérisme sélectif : ACTH
**Détection exclusive par la clinique! Respecter leur demande de dilution
Comment contourner ou identifier l’effet crochet?
Diluer l’échantillon jusqu’à l’obtention de résultats cohérents observés sur au moins 2 dilutions différentes
- Minimum 2 dilutions successives avec un résultat linéaire
- Attention, certaines compagnies ont vérifier l’effet crochet jusqu’à une concentration X qui peut être nettement inférieure à ce qu’on peut avoir dans nos labos
Quelles sont les différentes molécules signal / marqueurs utilisés pour les immunoessais?
- RIA : radio-isotope
- EIA : Enzyme (activité enzymatique)
- Peroxydase, PAL
- Selon le substrat et l’enzyme utilisée, l’activité de l,enzyme sera mesurée en photométrie, en fluorométrie ou en chimiluminescence
- FIA : Fluorophore
- Fluorescéine, rhodamine, Eu3+ (europium)
- CIA : Chimiluminescence
- Luminol, ruthénium
Quelles méthodes peuvent être utilisées par les fabricants d’immunoessais pour séparer la phase libre de la phase solide?
Très peu de limites. Beaucoup d’options
- Ab de capture lié à une phase solide
- Paroi d’un tube
- Bille à haute densité
- Bille magnétique
- Utilisation d’un agent précipitant ou d’un 2e Ab
- Compteur gamma
- Utilisation d’un pont streptavidine-biotine
Quelles techniques sont disponibles pour l’estimation de la fraction libre d’une hormone?
- Dialyse à l’équilibre (méthode de référence)
- Technique IE compétitif
- Technique par calcul
- Technique de précipitation
- Ex fraction biodisponible testo avec précipitation au sulfate d’ammonium
Quelle est la principale difficulté associée au dosage de la franction libre d’une hormone par immunoessais?
La fraction libre est généralement un faible pourcentage de la concentration totale de l’hormone
- L’IE ne doit pas perturber l’équilibre de la fraction liée <-> libre
- Demeure une estimation souvent imparfaite de la fraction libre
Quelles sont les 2 principales méthode immunologiques pour le dosage de la fraction libre des hormones?
Immunoessais compétitif
-
One step (analogue)
- Ajout de l’échantillon patient en même temps que l’Ag*
- Utilisation d’un analogue (Ag*) ayant peut d’affinité pour les protéines de liaison de l’Ag
- Lavage
- Mesure du signal
-
Two step (séquentiel)
- Liaison de l’analyte libre aux AB fixés sur support solide
- Lavage de l’échantillon patient contenant l’Ag lié
- Ajout de l’Ag*
- Lavage de l’excédant non lié
- Mesure du signal
Quels types de marqueurs sont les plus répendus pour les immunoessais?
- Chimiluminescent
- Fluorescents
Quels sont les avantages de l’automation des immunoessais?
- Permet l’analyse en mode sélectif (du test) plutôt qu’en batch
- Améliore la précision (en principe)
- Cadence élevée
- Intégration aux systèmes préanalytiques automatisés pour un meilleur temps réponse
- Parfois accessible en péri-opératoire ou au chevet du patient
Nommer des essais non-immunologiques
- Essais biologiques
- Essais utilisant des récepteurs ou protéines liantes
- chromatographie sur minicolonne et colorimétrie
- Séparation LC ou GC couplée à détection UV, MS, MS/MS ou ampérométrie
**Défi : rendre ces méthodes automatosables, moins complexes avec une meilleure cadence et des TAT plus rapides
Quel est l’avantage principal de la LC-MS/MS par rapport aux immunoessais?
Plus grande spécificité
- Intérêt marqué pour les petites molécules comme les stéroïdes
- Coût élevé à l’achat, mais compensé par le faible coût des réactifs
Nommer des critères de qualités associés aux dosages hormonaux
- Sensibilité
- Précision
- Exactitude
- Erreur totale
- VR
Quelle est la différence entre la sensibilité analytique et la sensibilité fonctionnelle?
- Sensibilité analytique (LOD) : La plus petite concentration que l’on peut statistiquement distinguer du bruit de fond
- Sensibilité fonctionnelle (LOQ) : La plus petite concentration que l’on peut mesurer avec < 10 ou 25% d’imprécision
Discuter de l’imprécision et de l’erreur totale acceptable pour les dosages immunologiques des hormones
- La plupart des tests endocriniens ont un CV de 5-15% pour les valeurs normales ou élevées
- CV double lorsque valeurs < VR
-
Les résultats entre les méthodes ne peuvent souvent pas être comparés d’un lab à l’autre
-
Ab différents
- Affinité différente
- Épitope différent
- Fenêtre dynamique différente
-
Ab différents
Discuter des limites des valeurs de référence des dosages immunologiques
À cause des coûts élevés, peu de labo valident leurs valeurs de référence proposées par les manufacturiers des trousses
- VR souvent californiennes ou européennes!!!
- BIAIS
Nommer les différents types d’interférence qu’on peut avoir dans les essais hormonaux immunologiques
- Réactivité croisée
- Anticorps hétérophiles et anti-animaux
- Masquage des Ag
- Interférence avec le système indicateur
- Effets de matrice
De quel type peuvent être les interférences des essais immunologiques?
- Positives ou négatives
- Ampleur variable
- Patient et système dépendants
Qu’est-ce que la réactivité croisée en immunoessais? Donner des exemples
Capacité de molécules distinctes de réagir avec un Ab
- Ex : Cortisol et désoxycortisol (urine)
- Ex : FSH, TSH, LH, hCG (SU alpha)
- Ex : Métabolites inactifs
Qu’est-ce qu’une interférence par hétérogénéité moléculaire? Donner des exemples
Présence de formes modifiées de la molécule d’intérêt
- Ex : hCG hyperglycosylée, clivée, fragment
- Ex : prolactine, dimère, macro-prolactine
- Ex : Métabolites inactifs
Identifier un défi particulier relié à la réactivité croisée dans l’urine
Les trousses sont validées pour le sérum (Ex : cortisol)
- Réactivité croisée avec des métabolites ou des formes conjuguées par toujours investigué
- Méthode non-immunologique à envisager pour contourner le problème de réactivité croisée dans une matrice autre que la matrice validée
- Toujours consulter le feuillet des manufacturiers, en particulier lorsqu’ils changent leur formulation!
Vrai ou faux : Il est peu probable que 2 systèmes différents “cross-réagissent” de la même façon
VRAI
Discuter de la stratégie de dosage par une autre méthode en cas d’interférence
Le dosage sur une autre méthode peut seulement nous indiquer s’il y a ou non possibilité d’une interférence.
- EN AUCUN CAS ON NE PEUT SAVOIR QUELLE MÉTHODE DIT VRAI!!
VRAI OU FAUX : L’hétérogénéité moléculair est méthode dépendant
VRAI
**C’est important de savoir ce que notre méthode reconnait et ne reconnait pas.
Ex : Insuline synthétique détectée ou pas pour ID cas d’hyperinsulinémie factice
Pourquoi est-il important de faire le suivi des patients avec la même méthode immunologique?
Les VR, interférents et LOD dépendent des méthodes.
- Les CQ externes témoignent bien de l’hétérogénéité des dosages avec les différentes méthodes. On ne doit pas transposer un résultat obtenu avec une autre méthode avec nos VR
- Malheureusement, les MD regardent plutôt uniquement le résultat que les VR pour certains dosages, surtout en cas de suivi endocrinologique
Vrai ou faux : Les macro-hormones sont reconnues par toutes les méthodes immunologiques
FAUX
Des résultats de CQ externes contenant des macro-hormones ont révélé que certaines méthodes les détectent alors que d’autres pas.
Quelle est la stragégie pour éliminer une interférence par une macro-hormone? Quelle est la limite de cette stratégie?
Précipitaiton au PEG pour éliminer la pro-hormone et doser uniquement la forme monomérique
- Cependant, le dosage n’est potentiellement pas exacte (précipitation complète? pas validé)
- On peut seulement dire qu’on avait une interférence.
Nommer 2 analytes biens connus pour avoir des interférences par des macro-hormones
hCG et prolactine
Que sont les Ab hétérophiles?
Ab qui réagissent contre différentes parties de l’Ab réactif de la méthode immunologique (faible affinité)
- Ab naturels ou auto-immuns
Qu’est-ce qu’un Ab idiotypique?
Ab qui reconnait la partie Fab de l’Ab de la méthode
- Interférence avec la partie des sites de liaison à l’Ag
Quels types d’ab hétérophiles peuvent causer des interférences?
- Facteur rhumatoïde
- Ab itiodype
- Ab anti-animaux
Quel est le mécanisme d’interférence causé par les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux?
- Peuvent interférer en créant un pont entre l’Ab de capture et l’Ab marqué (fausse augmentation)
- Peuvent interférer en neutralisant un ou les 2 Ab empêchant leur réaction (fausse diminution)
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (provenance/origine)
Ab anti-animaux :
- Ab spécifiques produits chez des individus après une exposition à des préparations d’origine animale ou suite à un contact prolongé avec des animaux
Ab hétérophiles :
- Ab naturels non spécifiques présents chez tous les individus
- Certains types sont associés à des maladies auto-immunes
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (spécificité/affinité)
Ab anti-animaux :
- Ab dirigés spécifiquement contre les protéines d’espèce animale en cause
- Affinités élevées
- Peuvent interférer dans tous les types d’IE
Ab hétérophiles :
- Ab de faible affinité
- Généralement pas spécifiques
- Interfèrent surtout dans les Ie de type immunométriques
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (blocage de l’interférence)
Ab anti-animaux :
- Interférence plus facile à bloquer
- Ajouter aux réactifs des protéines sériques de même source animale que celle des Ab
Ab hétérophiles :
- Interférences plus difficiles à bloquer
- Ab peuvent réagir avec plusieurs types d’Ab
Quelle est la fréquence estimée des Ab hétérophiles?
Environ 0,05%. Peut être plus, peut être moins
- Dépend aussi de la population/clientèle de l’hôpital
- Ex : beaucoup de maladie auto-immune, hopital en région avec des agriculteurs…
Comment détecter une interférence?
- Dépister l’erreur
- Résultat incohérent avec la clinique (CLINICIEN)
- Dilutions sériées qui ne concordent pas (LABO)
- Différente avec une autre technique
- Confirmer le bon résultat
- Résultat alternatif conforme à la clinique
- Éliminer l’interférence
- Techniques physiques ou agents bloquants
- *Certaines compagnies ont déjà des agents bloquants dans leur préparation
- Techniques physiques ou agents bloquants
Comment éliminer les interférences hétérophiles?
- Par élimination des Ab avant dosage
- Ultracentri
- Chauffage 90°C
- PEG
- Par blocage non-spécifique des Ab pendant le dosage
- Globulines non immunes
- Sérum animal (> 2 espèces)
- Dilution sériées avec sérum animal
- Par blocage spécifique des Ab pendant le dosage
- Ig anti Ab hétérophile et HAMA
- IgG monoclonales de souris anti IgM humaines
Nommer des interférences possibles avec le système indicateur (sinal) en IE
- Radioactivité dans le spécimen
- Augmentaiton pathologique de l’enzyme utilisée dans un EIA (Ex : PAL)
- Ab anti-ruthénium
- Substances fluorescentes ou atténuantes en FIA
- Substances atténuantes dans les CIA
Discuter de l’interférence de la biotine avec les dosages hormonaux
Biotine exogène peut interférer avec le système de détection utilisant la liaison biotine-streptavidine
- Interférences peuvent causer des profils pathologiques!
- TSH dosée en sandwich. Biotine = fausse diminution du signal. Signal directement proportionnel. TSH diminuée
- T4L dosée en compétitif. Biotine = fausse diminution du signal. Signal inversement proportionnel. T4L augmentée
- Dx d’hyperthyroïdie crée par une interférence à la biotine!!!
Quelles sont les utilisations pharmacologiques de la biotine?
- Déficience génétique en biotinidase
- Maladies métaboliques mitochondriales
- Crampes chez les hémodialysés
- Sclérose en plaque évolutive
- Syndromes de malabsorption
- Nutrition parentérale totale
