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Cours A2020 > Bio mol - Cours 2 Dx moléculaire (analytique) > Flashcards

Bio mol - Cours 2 Dx moléculaire (analytique) Flashcards

1
Q

Nommer les 5 champs d’application de la médecine de laboratoire

A
  • Biochimie
  • Microbiologie
  • Hématologie/banque de sang
  • Anatomopathologie et cytologie
  • Génétique moléculaire
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Q

Décrire le champ d’application de la génétique médicale dans la médecine de laboratoire (population cible, mission, analyses)

A
  • S’intéresse au bien-être des peronnes qui présentent ou qui sont à risque de présenter une maladie génétique
  • La génétique médicale inclut l’évaluation, l’investigation, le conseil génétique et le traitement de ces personnes
  • Analyse biomédicale : Analyse de la structure moléculaire de l’ADN nucléaire ou mitochondrial ou l’ARN associé à une maladie ou à une condition pathologique d’origine génétique
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3
Q

Qu’est-ce que le diagnostic moléculaire?

A

Analyse qualitative ou quantitative des acides nucléiques (ARN et ADN) dans un spécimen biologique à des fins de prévention, de dépistage, de Dx, de Px ou de suivi de l’état de santé des individus

**Inclut tout type d’analyse reposant sur l’étude directe des acides nucléiques dans un spécimen biologique : cytogénétique/génétique/microbiologie/pathologie/oncologie/pharmacogénétique MOLÉCULAIRE

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4
Q

Quel est la théorie fondamentale de la biologie moléculaire par James Watson?

A

ADN -> ARN -> Protéines

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5
Q

Nommer différentes techniques de biologie moléculaire (amplification d’acides nucléiques)

A

TAAN : Test d’amplification des acides nucléiques

  • PCR semi quantitatif
  • PCR en temps réel
  • PCR isotherme
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6
Q

Nommer des techniques de génotypage et de séquençage

A
  • Spectrométrie de masse
  • Micropuce
  • Séquençage Sanger
  • Séquençage NGS
  • Séquençage de 3e génération
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7
Q

Quel est le principe de base du PCR (Polymerase chain reaction)?

A
  • Dénaturation
  • Hybridation
  • Extension

3 étapes effectuées à des températures différentes

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8
Q

Qu’est-ce que le PCR semi-quantitatif?

A

PCR traditionnel ou PCR en point final

  • Amplicifation de l’ADN et mesure de la quantité à la fin
  • Migration sur gel pour visualiser l’ADN
  • Quantification semi-quantitative si des standards de concentration connue sont appliqués sur gel
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9
Q

Quelles sont les caractéristiques analytiques du PCR semi-quantitatif?

A
  • Faible précision
  • Faible sensibilité
  • Non-automatisé
  • Grande composante manuelle
  • PCR en point final : LONG
  • Bromure d’éthidium toxique
  • Semi-quantitatif

Pas approprié pour la routine dans un laboratoire clinique

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10
Q

Quel est le principe analytique du PCR en temps réel?

A
  • Amplification PCR traditionnelle, mais avec quantitifation de l’ADN durant la phase exponentielle du PCR lorsque la quantité de produit d’ADN est directement proportionnelle à la quantité d’acide nucléique “matrice”
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11
Q

Quelles sont les caractéristiques analytiques du PCR en temps réel?

A
  • Meilleur précision
  • Meilleur sensibilité
  • Possibilité de standardisation
  • Automatisable
  • Rapide
  • Peu de manipulations nécessaires
  • S’adapte facilement à un laboratoire médical
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12
Q

Comparer le PCR en point final et le PCR en temps réel

A
  • Le PCR en point final est semi-quantitatif alors que le PCR en temps réel est quantitatif
  • L’analyse est plus longue pour le PCR en point final
  • Le PCR en point final ne peut pas être automatisé
  • Utilisation d’un agent intercallant cancérigène pour le PCR en point final
  • PCR en point final ne peut pas être utilisé de routine
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13
Q

De quels facteurs dépend l’efficacité de la PCR?

A
  • Du design des oligonucléotides (primers)
  • Des conditions et températures des cycles
  • De la présence d’inhibiteurs pouvant limiter l’amplification (efficacité pas toujours 100%)
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14
Q

Comment le design des oligonucléotides affecte-il l’efficacité de la PCR?

A
  • Distance plus courte entre les primers = plus petits produits = amplification plus efficace et plus rapide
  • Éviter l’auto-appariement des primers
  • S’assurer de la spécificité
    • Éviter séquences répétitive et s’assurer d’éviter les séquences similaires non-voulues (Outil BLAST du NCBI)
  • Longueur optimale : 18-25 bases
  • Choisir des primers avec des températures de dénaturation similaire
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15
Q

Comment les conditions/températures des cycles affectent-ils l’efficacité de la PCR?

A
  • Performance suppérieure si on évite les plateaux de température ou les pauses
  • L’efficacité de la PCR augmente si on effectue une amplification rapide
  • Processus extrêmement rapides (dénaturation/appariement en 1 seconde suivant l’obtention de la température)
  • Vitesse d’élongtion : typiquement de 50 à 100 bases/sec
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16
Q

Vrai ou faux : L’amplification PCR est un processus qui comporte 3 phases (Dénaturation, hybridation, extension) qui impliquent des plateaux de température pour chaque phase

A

FAUX

Il est vrai de dire que des “braquettes” de températures sont associées aux différentes phases de la PCR, mais la PCR est un processus dynamique où on peut retrouver les différentes phases aux mêmes températures!

Beaucoup de développement actuellement pour éviter les plateaux de température et augmenter la spécificité de la PCR

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17
Q

Compléter la phrase :

La spécificité de la PCR augmente lorsque les cycles sont plus __________

A

La spécificité de la PCR augmente lorsque les cycles sont plus COURTS

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18
Q

Comment la présence d’inhibiteurs peut affecter l’efficacité de la PCR? (mécanismes)

A

Des inhibiteurs de PCR peuvent interagir directement avec l’ADN ou d’autres composantes et bloquer l’activité de la polymérase

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19
Q

Nommer des exemples d’inhibiteurs qu’on peut retrouver dans différents types de matrice biologique

A
  • Urine :
    • Sang, urée, mucine, bilirubine
  • Sang :
    • Hème, IgG
  • Nasopharyngé :
    • Différents Rx, mucine
  • Selles :
    • Sels biliaires
  • Tubes et préservatifs :
    • Héparine, formaline, swabs avec gel ou charbon
  • Endocervicaux/vaginaux :
    • Sang, mucine, poudre
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20
Q

Quel est le principe analytique du PCR isotherme?

A

Méthode d’amplification isotherme : L’étape de dénaturation thermique a été remplacée par des protéines accessoires (hélicase, recombinase) ou par déplacement de brin

  • Méthode non limitée par les contraintes du cyclage thermique
21
Q

Quels sont les avantages de l’amplification isothermale par rapport à la PCR?

A
  • Ne nécessite pas de thermocycleur
  • Peut être très rapide!
22
Q

Nommer différentes techniques d’amplification isothermale

A
  • Amplification basée sur la transcription (Transcription-mediated amplification, TMA)
  • Amplification basée sur le déplacement de brin (Strand displacement amplification, SDA)
  • Amplification hélicase dépendante (Helicase dependant amplification, HDA)
  • Amplification médiée par boucle (Loop-mediated amplification, LAMP)
23
Q

Quel est le principe analytique de l’amplification basée sur la transcription (TMA) (PCR isotherme)?

A
  • Amplification à partir d’ARN
  • Méthode basée sur la réplication des rétrovirus
  • Utilise les activités combinées de la
    • Reverse transcriptase (Transcriptase inverse + RNAse H)
    • ARN polymérase
  • Aucune variation de température

Principe :

  • 2 amorces utilisées, dont 1 qui contient la séquence promotrice pour l’ARN polymérase
  • Amplification par la reverse transcriptase : hybride ARN-ADN
  • Brin d’ARN dégradé par la RNAse H
  • Liaison de la 2e amorce à l’ADN sb
  • Élongation de la reverse transriptase pour produire ADN db (avec promoteur)
  • Promoteur reconnu par l’ARN polymérase : Production de 100-1000 copies d’ARN à partir d’un brin d’ADN
  • Chaque brin d’ARN lie l’amorce pour production de l’hybrtide ARN-ADN… RNAse H… ds DNA… Production d’ARN… ARN-ADN…..
24
Q

Quel est le principe analytique de l’amplification basée sur le déplacement de brin (SDA) (PCR isotherme)?

A
  • Technique d’amplification d’ADN
  • Requiert la génération de matériel de départ
    • Dénaturation initiale par chauffage
  • 4 amorces :
    • 2 pour le déplacement
    • 2 internes pour l’ajout d’un site de restriction
  • Utilise d’activité d’une enzyme de restriction qui coupe d’ADN simple brin

Principe :

  • Dénaturation en amplification des ADN double brin avec un site de restriction
  • Clivage sp (nick)
  • Extension du site entaillé avec déplacement du brin
  • Amorçage du brin déplacé avec l’amorce interne d’origine qui comprend le site de restriction
  • Extension à la fois de l’amorce et du brin déplacé, formant un nouveau produit double brin avec le site de restriction
25
Q

Quel est le principe analytique de l’amplification hélicase dépendante (HDA) (PCR isotherme)?

A
  • Utilisation de l’activité ADN hélicase en présence d’ATP
  • Séparation des 2 brins, ligation des primers et amplification
  • Pas de température d’initiation requise
  • Amplification asynchrone avec cinétiques semblables au PCR
  • Utilise une polymérase à déplacement de brin
  • Très spécifique
  • Très rapide
26
Q

Quel est le principe analytique de l’amplification médiée par boucle (LAMP) (PCR isotherme)?

A
  • Au lieu de produire de longs fragments, production de fragments de longueurs différentes avec des branches et des boucles
  • Requiert un minimum de 4 amorces (recommandé d’en utiliser 6 : très spécifique)
  • Les amorces contiennent des séquences complémentaires à des sites amplifiés pour faciliter la formation des boucles
  • Structures «en boucle» facilitent les cycles ultérieurs d’amplification par extension sur les boucles et hybridation supplémentaire des amorces
  • Forme une structure “dumbblle” (altère)
  • Détection colorimétrique par changement de pH
27
Q

Quelles sont les applications potentielles, les avantages et les inconvénients de la technologie LAMP?

A
  • Fréquemment utilisé pour la détection des pathogènes
    • Performances peuvent excéder la PCR, les immunoessais et la culture
  • Très robuste (résistant aux interférences)
  • Mise au point complexe
28
Q

Comparer les méthodes d’amplification isothermales (TMA, SDA, HDA et LAMP) pour :

  • Matériel de départ
  • Type d’amplification
  • Nombre de primer
  • La nécessité d’une température d’initiation
  • Sensibilité analytique
A
  • TMA:
    • ARN, amplification ARN, 2 amorces
    • Pas de T° d’initiation requise
    • Sensib : 1 copie
  • SDA :
    • ADN, amplification ADN, 4 amorces
    • T° d’initiation requise (95°C)
    • Sensib : 10 copies
  • HDA :
    • ADN, amplification ADN, 2 amorces
    • Pas de T° d’initiation requise
    • Sensib : 1 copie
  • LAMP :
    • ADN, amplification ADN, 4-6 amorces
    • Pas de T° d’initiation requise
    • Sensib : 5 copies
29
Q

Quel est le principe analytique du séquençage Sanger?

A

Repose sur le principe de terminaison de chaîne avec d’utilisation de ddNTP

  • Amplification de l’ADN avec les 4 dNTP classiques
  • Échantillon réparti dans 4 contenants différents
  • Ajout de ddNTP modifié avec fluorochrome qui stop l’amplification (1 type de ddNTP par contenant)
  • L’amplification stop à différents endroit dans la séquence d’ADN
  • Migration sur gel d’acrylamide pour visualiser la différence d’une pb entre chaque amplicon
  • Séquençage obtenu
30
Q

Vrai ou faux : Le séquençage Sanger n’est pratiquement plus utilisé aujourd’hui depuis l’arrivée du séquençage nouvelle génération

A

FAUX

Sanger reste le gold standard du séquençage.

Encore utilisé couramment, notamment pour valider les résultats du séquençage de nouvelle génération

31
Q

Qu’est-ce que le séquençage nouvelle génération (NGS)?

A
  • Séquençage à haut débit
  • Séquençage en parallèle (millions/milliard de séquence en même temps)
32
Q

Quel est le principe analytique du séquençage nouvelle génération (NGS)?

A
  • Préparation de la librairie
    • Fragmentation aléatoire du génome
    • Ligature avec des adaptateurs appropriés
  • Génération des groupes (clusters)
    • Hybridation des adapteurs de la librairie
    • Amplification sur un support solide
    • Génération d’ADN sb
  • Séquençage (Ex du Illumina)
    • Utilisation de dNTP ayant chacun leur signal fluorescent (fluorophore)
    • 1 dNTP ajouté à la fois et signal enregistré/lu
    • Fluorophore clivé et dNTP suivant incorporé
  • Analyse de données
33
Q

Qu’est-ce que le séquençage “Exome”?

A
  • Méthode de séquençage ciblée la plus utilisée
  • Séquence moins de 2% du génome humain, mais contient la majorité des variants connus pour causer des pathologies
  • Au lieu de se concentrer sur les gènes candidats, toutes les régions codantes du génome sont ciblées pour un criblage non biaisé des variantes codantes
34
Q

Quels sont les avantages et les inconvénients du séquençage “Exome”?

A

Avantages :

  • Coût-efficace comparativement au whole-genome
  • Identifie la plupart des variants causant les pathologies
  • Amélioration récente mène à des TAT rapides

Inconvénients :

  • Technique non-standardisées et couverture hautement variable
  • Problématique pour régions réfractaires (pseudo-gènes, régions codantes hautement répétitives, grandes délétions et duplications)
  • Régions GC-riches et GC-faibles plus difficiles à séquencer = couverture diminuée
  • Variation importante d’un labo à l’autre pour la profondeur et l’identification des variants
35
Q

Discuter du séquençage “Genome” (avantages/inconvénients)

A

La méthode la plus efficace de déterminer 3.2 milliards de base du génome humain

  • Avantages :
    • Préparation simple
    • Peut identifier les variants structuraux et cassures de chromosomes dans les régions non-codantes
  • Inconvénients :
    • Coût significativement plus élevé que le séquençage “exome”
    • Technique avec couverture non-standardisée et hautement variable
    • Nombre élevé de variants de signification inconnue
36
Q

Qu’est-ce que le séquençage ciblé?

A

Un sous-groupe de gènes ou régions du génome sont isolés et séquencés

37
Q

Quels sont les avantages et les inconvénients du séquençage ciblé?

A

Avantages :

  • Niveaux de couverture plus élevés ??
  • Paneaux de couverture peuvent être pré-déterminés ou peuvent être modulés
  • Plus facile à analyser, TAT plus rapide
  • La sensibilité clinique peut être suppérieure au séquençage de l’exome ou du génome
  • Pas de trouvailles non voulues

Inconvénients:

  • Limité à certaines pathologies particulières
  • Le choix du paneau de gène peut être difficile à choisir pour lse cliniciens (phénotype moins bien défini)
38
Q

Nommer des applications cliniques du séquençage NGS

A
  • Dépistage/Dx de pathologies diverses
  • Non-invasive prenatal testing
  • Dépistage de risque de cancer
  • Dépistage de maladies génétiques
  • Réponse aux Rx

Court/moyen terme :

  • Détection de cancer aux stades les plus précoces
  • Séquençage du génome entier
39
Q

Pourquoi le NGS révolutionne les laboratoires médicaux?

A
  • Démocratise les analyses génétiques et permet de connaitre :
    • Prédispositions à souffrir de maladies
    • Prédispositions à transmettre ces maladies à la génération suivante
    • Rsiques de développer un cancer
    • Présence d’anomalie génétique foetale de façon non-invasine
40
Q

Qu’est-ce que le séquençage de 3e génération?

A

Les technologies de troisième génération ne fragmentent pas et n’amplifient pas l’ADN: elles séquencent directement une seule molécule d’ADN

  • Très rapide
  • Cadence très élevée
  • Produit des lectures très longues
  • Haut taux d’erreur
  • Potentiel virutellement illimité (très prometteur)
    • Microbiome, maladie infectieuse, analyse de l’eau, science judicière….

Ex Nanopore :

  • Modifications d’un courant électrique lorsque les acides nucléiques passent à travers une protéine membranaire “nanopore”.
  • Le signal résultant est décodé pour fournir la séquence d’ADN ou d’ARN spécifique.
41
Q

Quelle est la différence entre “séquençage” et “génotypage”?

A

Génotypage :

  • Processus de détermination des variantes génétiques qu’un individu possède

Séquençage :

  • Méthode utilisée pour déterminer la séquence exacte d’une certaine longueur d’ADN
  • Peut être utilisé pour génotyper quelqu’un pour des variantes connues, ainsi que pour identifier des variantes qui peuvent être uniques à cette personne.
42
Q

Nommer des technilogies utilisées pour le génotypage

A
  • Technologie BeadArray Microarray
  • Technologie MassArray
43
Q

Quel est le principe analytique de la technologie “BeadArray Microarray”?

A
  • Billes de silicone de 3µm couverte avec des centaine de millier de copies d’oligonucléotide spécifique
  • Fragment d’ADN passe dans la région des billes et se lie à la séquence complémentaire
  • La liaison se fait juste avant la région d’intérêt
  • La spécificité allélique est conférée par une seule extension de base qui incorpore l’un des quatre nucléotides marqués
  • Lorsqu’il est excité par un laser, le marqueur nucléotidique émet un signal. L’intensité de ce signal transmet des informations sur le rapport allélique à ce locus.
  • IDENTIFICATION DE VARIANT
44
Q

Qu’est-ce que la technologie “MassArray”?

A

Utilisation de la MS (MALDI-TOF) pour la détection d’amplicons produits par PCR

  • Amplification de fragment spécifique d’ADN
  • Transfert sur le support pour la désorption-onisation laser assistée par matrice
  • Détection par TOF (séparation basée sur la masse des amplicons)
  • IDENTIFICATION DE VARIANTS
45
Q

Qu’est-ce ce qu’une biopsie liquide?

A

Les «biopsies liquides» sont basées sur l’analyse des cellules tumorales circulantes (CTC), de l’ADN tumoral circulant (ctDNA) ou des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs, qui ont été rejetées par les tumeurs et leurs sites métastatiques dans le sang

46
Q

Vrai ou faux : Pour les biopsie tumorales, une meilleure sensibilité est obtenue en utilisant de ctDNA (ADN circulant tumoral) plutôt que les CTC (cellules tumorales circulantes)

A

VRAI

47
Q

Quelles pourraient être les implications des biopsie liquides?

A
  • Peut permettre ID d’un Tx spécifique à une mutation d’un gène spécifique
  • Peut permettre de détecter un cancer au stade précoce
    • Association entre ctDNA et survie a été associé dans certains cancers
  • Pourrait être utile pour repérer les récidives de cancer (médecine personnalisée)
  • Pourrait être utilisé en première intention avant biopsie solide? Moins invasif. Pourrait permettre d’orienter le patient vers le bon Tx en fonction de la signature génétique de la tumeur
48
Q

Quels sont les difficultés rencontrés pour l’implantation des biopsies liquides en médecine?

A
  • Les processus pathologiques sont hétérogènes
  • Microenvironnement dynamique : % ctDNA très variable d’un invidivu et d’une condition à l’autre
  • % ctDNA souvent < 4% (vs ADN foetal circulant = environ 10%)
  • Difficile à standardiser
49
Q

Est-ce utile de détecter les tumeurs de façon précoce?? (utilité des biopsies liquides)

A
  • Non…
  • Plus on détecte des tumeurs petites, plus on fait du sur diagnostic (Ex du cancer du sein)
    • Peut prendre plusieurs années avant qu’un cancer soit significatif
    • Si trop petit, imagerie inutile. Confirmation?
  • Coût de dépistage précoce élevé pour peu d’avantages…

Cours A2020 (27 decks)

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