W2HC7: Next Generation Sequencing

Question 1

PCR

Answer 1

• begin met 1 dubbelstrengs DNA die je uit elkaar haalt
• DNA primers aanbinden
• mbv polymerase DNA synthese
• met hoge temperatuur weer uit elkaar halen en door naar de volgende cyclus

Question 2

Aplicon Enrichment

Answer 2

Dee regio waarvan je geïnteresserd bent, ga je amplificeren (PCR), zet je een adaptor aan voor het DNA en ga je sequencen

Question 3

Hybridization Enrichment

Answer 3

Je fragmenteert het DNA, laat er een probe op los en met stretavidine beads vang je het specifieke deel vh DNA dat je wil (pull down), en bind, daarna sequencing

Question 4

Ilumina sequencen

Answer 4

Fragmenten met adaptors bind je aan een flowcel -> PCR reactie -> dissociatie strengen die door PCR gemaakt zijn -> ophoping moleculen -> sequentie reactie: strengen worden vanaf de bovenkant verlengd en elke keer als een nucleotide wordt ingebouwd, komt er een signaal vanaf.

Question 5

Barcodes

Answer 5

• specifieke stukjes DNA die uniek zijn
• aan jouw DNA fragment wordt een stukje DNA gezet waarin de sequenties zitten nodig voor sequencing, die nodig zijn voor onderscheid.
• mogelijk 1 flowcel te gebruiken maar naar meerdere patiënten te kijken

Question 6

Coverage

Answer 6

• aantal malen dat een base-positie bepaald is

- hoe hoger de coverage hoe ‘deeper’ gesequenced

Question 7

Variant Allel Frequentie (VAF)

Answer 7

• aantal malen dat een variant op een specifieke positie gevonden is tov referentie
• afhankelijk van gen en tumorcelpercentage

Question 8

Toepassingen NGS in moleculaire pathologie

Answer 8

• DD
• therapiekeuze
• clonaliteitsanalyse (metastase of 2e tumor)
• oncogenetica
• weefselidentificatie