Vettori di clonaggio e Proteine ricombinanti Flashcards
Per quali scopi vengono prodotti RNA e proteine in vitro? Grazie a quali molecole è possibile la produzione in vitro?
175
Che cosa significa produrre RNA e proteine in vitro e quali principi devono necessariamente essere rispettati?
175/176
Quale molecola è necessaria affinché ci possa essere una produzione in vitro di RNA e proteine? In che tipo di sistema deve essere inserita e tramite che cosa viene fatto?
176
Che cos’ è un plasmide, dove si trova e quali sono le sue principali caratteristiche e funzioni?
176
Qual’è l’ elemento fondamentale che deve essere presente nella struttura di un plasmide e per quale motivo? Quali possono essere altri due elementi strutturali utili per il plasmide?
176
Quando i plasmidi sono definiti coniugativi?
176
Come viene visualizzata la struttura di un plasmide in laboratorio?
176
Quali due caratteristiche di un plasmide permettono di essere inseriti e amplificati come DNA esogeno in una cellula batterica ospite?
177
Da che cosa è affiancato il gene di interesse nei plasmidi per la produzione di una proteina desiderata nella cellula ospite?
177
Quali sono le fasi che vengono svolte nel modificare la struttura di un plasmide per renderlo in grado di autoreplicarsi e produrre proteine in una cellula ospite?
177
Attraverso quale processo è possibile inserire un gene target in un plasmide e quali sono gli elementi fondamentali che devono essere presenti?
177
Tramite quali due sistemi si otterrà in poco tempo una grande quantità di plasmide in cellule ospiti?
177
A cosa serve nello specifico l’inserimento di un gene per la resistenza ad antibiotico in un plasmide?
177
Data la non spontaneità nell’ inserire un plasmide in una cellula, quali due metodi di trasformazione vengono impiegati per farlo?
178
Cosa si fa una volta ottenuta una quantità sufficiente di plasmidi nelle cellule batteriche?
178
Quali altri vettori vengono utilizzati, per esigenze di ricerca, quando non basta la quantità di plasmidi ottenuti dopo la loro replicazione nelle cellule, e che caratteristiche devono avere?
178
Cosa possiede la cellula batterica per assimilare DNA dall’ esterno nel caso della coniugazione e nel caso della trasformazione?
179
Come si rende una cellula competente alla trasformazione, per inserire un DNA esogeno in una cellula?
179
Cosa bisogna fare dopo aver reso una cellula competente alla trasformazione, per inserire DNA esogeno al suo interno?
180
Cosa bisogna fare dopo aver introdotto DNA esogeno all’ interno di una cellula nel processo di trasformazione con heat shock?
180
Perché il processo di trasformazione delle cellule competenti con il DNA plasmidico risulta essere molto poco efficiente? Cosa viene fatto per risolvere questo problema?
180
Che principio sfruttato i geni per la resistenza agli antibiotici e cosa devono possedere affinché vengano trascritti nel plasmide introdotto nella cellula batterica?
180
Cosa deve possedere il terreno solido in cui è introdotta la popolazione batterica che ha introdotto il plasmide, oltre all’ antibiotico?
181
Quale è il processo in cui si isola una sequenza di DNA di interesse e la si inserisce in un vettore?
182
Da che tipo di acido nucleico e costituito il vettore che serve al clonaggio molecolare e per quale motivo?
182
Da dove si può prendere oggi la sequenza di DNA di interesse per il clonaggio molecolare?
182/183
Che tipo di reazione è l’inserimento della sequenza nel vettore, nel clonaggio molecolare, quali sono le due fasi e quali sono le due classi di enzimi che vengono utilizzate?
183
Quali sono nello specifico le nucleasi che servono per il taglio nel clonaggio molecolare? Come vengono sfruttate normalmente dal batterio?
183
Come sono i siti riconosciuti dalle endonucleasi di restrizione nel clonaggio molecolare?
184
Attraverso che cosa l’endonucleasi di restrizione nel batterio riesce a discriminare il DNA fagico, da quello del cromosoma batterico?
184
Quale tipo di legame tagliano nello specifico gli enzimi di restrizione nel clonaggio molecolare e che caratteristiche hanno le estremità che si vengono a formare dopo il taglio?
184
Perché le estremità appiccicose, che si ottengono dopo il taglio di enzimi di restrizione nel clonaggio molecolare, sono già predisposte a legarsi con le estremità del gene di interesse da inserire?
185
Quando si viene a creare la molecola ibrida vettore-inserto nel clonaggio molecolare, l’inserto è debolmente legato, cosa manca per il legame completo?
185
Cos’ è il multiple cloning site e che vantaggio offre nel clonaggio molecolare?
185
Se il taglio effettuato da enzimi di restrizione nel clonaggio molecolare è simmetrico, che tipo di estremità si formano, e di conseguenza come può cambiare il legame tra inserto e vettore?
185
A quale tecnica si ricorre per il clonaggio molecolare, se il gene di interesse non è inserito in nessun vettore di origine o è mutante?
186
Cosa bisogna fare nella produzione di un inserto tramite PCR, per il clonaggio molecolare, a livello dei primer per il gene di interesse?
186
Nella produzione di un inserto tramite PCR, nel clonaggio molecolare, che avviene e cosa viene prodotto dopo il primo ciclo di PCR?
192
Nella produzione di un inserto tramite PCR, nel clonaggio molecolare, che avviene e cosa viene prodotto dopo il secondo ciclo di PCR?
192
Nella produzione di un inserto tramite PCR, nel clonaggio molecolare, che avviene e cosa viene prodotto dopo il terzo ciclo di PCR (prodotto finale)?
192
Oltre che alla sequenza di interesse, con i siti di restrizione per le endonucleasi da inserire in un vettore nel clonaggio molecolare, cosa deve essere presente e come viene inserito nel plasmide?
186
Cosa deve essere presente nella provetta per la trascrizione in vitro di un mRNA, dopo che si è fatto il clonaggio molecolare?
186
Che tipo di RNA polimerasi si utilizza per la trascrizione in vitro di un mRNA dopo clonaggio molecolare, e quali sono i vantaggi?
186/187
Cosa devono far parte del template di trascrizione post linearizzazione del plasmide nella trascrizione di mRNA in vitro
187
Una volta prodotti con trascrizione mRNA in vitro in seguito a clonaggio molecolare, cosa bisogna aggiungere per mantenere stabile il messaggero e per renderlo utilizzabile per la traduzione?
187
Cosa si potrà fare con gli mRNA prodotti in vitro post clonaggio molecolare? Che ruolo hanno nella produzione di vaccini e, nello specifico di vaccini antitumorali?
187/188
Quale è il rischio principale legato all’ uso di vettori virali, da cosa deriva, quali due situazioni si possono verificare?
188
I vettori a mRNA possono essere sfruttati per trasformare una cellula in iPSC? Se sì, perché e che tipo di template vengono utilizzati per farlo?
188
Quali passaggi ed elementi servono in ordine per rendere i plasmidi contenenti i geni OSKM pronti per essere trasferiti in cellule differenziate come fibroblasti?
188
Come si può rendere facile il trasferimento di plasmidi contenenti geni OSKM all’ interno di cellule differenziate come fibroblasti?
188
Una volta inglobati i plasmidi contenenti geni OSKM nelle cellule differenziate, cosa accade per fare si che possano diventare iPSC?
189
Quale è il vantaggio di creare iPSC con vettori ad mRNA piuttosto che con vettori virali?
189
Cosa inducono gli mRNA che sono stati introdotti nelle cellule eucariotiche per mezzo di plasmidi? Come viene risolto questo problema?
189
Se si ha l’obiettivo di fare produrre una proteina ricombinante in grande quantità grazie ad un plasmide col gene di interesse, quali sono i tre sistemi per farlo e che elementi sono necessari in ciascun caso?
189
Prima che venga fatta produrre in grande quantità una proteina ricombinante da una popolazione cellulare, dopo aver inserito il plasmide, in quali condizioni devono trovarsi le cellule che hanno inglobato il plasmide?
190
Una volta iniziata la produzione di una proteina ricombinante nelle cellule che hanno inglobato il plasmide col gene, come risulta essere questa nei confronti della cellula e della sua attività di replicazione?
190
Sotto quale sistema di induzione viene posto il controllo della produzione di mRNA nelle cellule batteriche che hanno inglobate il plasmide col gene per una proteina ricombinante?
190
Perché è utile mettere il gene di interesse, di un plasmide inglobato da una cellula batterica, sotto il controllo di un promotore e di una RNA polimerasi fagica?
190
Come viene regolata la produzione di RNA polimerasi fagica dal sistema di controllo dell’ operone LAC (in merito alla produzione di una proteina ricombinante in una cellula batterica)?
190/191
Come è stato possibile ottenere la sequenza del gene dell’ insulina a partire dalla sequenza della proteina?
191
Una volta che è stata trovata la sequenza del gene dell’ insulina cosa si è fatto per arrivare alla sintesi della proteina funzionale in vitro?
191
Una volta che l’insulina funzionale è stata ricreata in vitro, come può essa innescare la cascata di signaling nella cellula target?
191
Cosa devono avere rispettivamente il plasmide per l’insulina ricombinante inserito in una cellula batterica (E.Coli) e il plasmide per l’insulina ricombinante inserito in una cellula eucariote (lievito), per fare terminare la trascrizione del gene?
191/192
