PCR, RT-PCR, qRT-PCR Flashcards
Cosa significa verificare l’ espressione genica e quali sono le strategie utilizzabili per farlo?
149
Nello studio dell’ espressione di un gene, verificabile trovando l’mRNA o proteine associate ad esso, come si può risolvere il problema legato all’ eccessiva piccolezza o bassa quantità di questi ultimi in un campione?
149
Cosa significa fare PCR, da chi fu inventata e per quale patologia?
150
Cos’ è necessario inserire in provetta per la PCR affinché possa avvenire il processo di replicazione del DNA?
150
Quali sono le caratteristiche chimiche della soluzione inserita nella provetta per PCR?
150
Cosa è necessario che avvenga nella PCR dopo aver preparato la provetta contenente il campione e quanto DNA dovrà essere presente alla fine per fare si che sia visibile all’ occhio umano?
150
Quale molecola è necessaria nella PCR per fare legare la DNA polimerasi al filamento stampo, in corrispondenza di cosa si dovrà appaiare, quali sono le sue caratteristiche e perché queste sono necessarie?
150
Perché nella PCR si una una coppia di primer anziché utilizzarne uno singolo? Come si dispongono l’uno rispetto all’altro?
151
Perché si sceglie un primer a DNA anziché ad RNA?
151
Dopo l’appaiamento dei primer sui filamenti stampo nella PCR cosa avviene e cosa si ottiene nella fase successiva?
152
Cosa si ottiene dopo 2 cicli di PCR? Cosa invece dopo 3 cicli? Quindi che succede ad ogni ciclo?
152
Quale molecola nella PCR mi darà conferma dell’espressione di un gene del DNA? Da cosa è delimitato alle estremità? In quale fase della PCR si formerà per la prima volta?
153
Quali sono le tre fasi della PCR, cosa accade in ciascuna di esse? Cosa accade al termine della terza fase?
153
Cosa si troverà alla fine della PCR nel tubo di reazione?
153
Come si ottiene la denaturazione del DNA nella prima fase della PCR? Che temperatura si usa?
154
Che temperatura si usa nella fase di annealing della PCR e perché?
154
Che temperatura si usa nella fase di extension della PCR e perché?
154
Che tipo di strumento si utilizzava inizialmente per passare da una temperatura all’ altra nelle varie fasi della PCR e come veniva utilizzato?
154
Quale DNA polimerasi si utilizzava inizialmente nella PCR, da quale venne poi sostituita e quali sono le caratteristiche della seconda che la rendono più efficiente rispetto alla prima?
154
Da quale strumento furono sostituiti i termoblocchi nella PCR? Quale è il vantaggio?
155
La reazione della PCR procede all’ infinito o vi è un limite?
155
Se si proietta su un grafico la quantità di prodotto che via via si ottiene con la PCR in relazione al numero dei cicli, come è la curva? Che cos’ è la fase di Plateau?
155
Quale è il primo principio che viene sfruttato nell’ elettroforesi su gel di Agarosio?
156
Quale è il secondo principio che viene sfruttato nell’ elettroforesi su gel di Agarosio?
156
Cos’ è il DNA ladder nell’ elettroforesi su gel di Agarosio?
156
Quali sono le fasi che si susseguono nel preparare il mezzo per fare elettroforesi su gel, prima di inserire il prodotto della PCR?
156
Quali sono le fasi che si susseguono nell’ elettroforesi su gel dopo aver inserito il prodotto della PCR nei pozzetti del gel di Agarosio? Che cosa posso verificare?
156/157
A cosa serve il transilluminatore nell’ elettroforesi su gel?
157
Cosa viene usato nella RT-PCR, come template al posto dell’RNA?
160
Quale enzima converte RNA in cDNA, per utilizzarlo come template per la RT-PCR? Da quale virus viene sfruttato? Cosa si ottiene al termine della retro trascrizione? Di quale molecola c’ è bisogno per fare iniziare il processo?
160
Quale tipo di RNA si utilizza per essere convertito in cDNA per la RT-PCR, se si deve valutare l’espressione di un gene protein coding o lncRNA? Quale sua caratteristica viene sfruttata per disegnare un primer, come verrà quindi disegnato e dove partirà la retro trascrizione?
160/161
Cosa si utilizzano come primer per retro trascrivere rRNA e tRNA in cDNA nella RT-PCR?
161
Una volta ottenuta la molecola ibrida di RNA e DNA post retrotrascrizione, nel processo di RT-PCR, si può usare direttamente come template? Altrimenti cosa viene fatto?
161
Quali sono gli strumenti di partenza e le fasi per misurare l’induzione dell’ espressione del citocromo2a1 in risposta ad un farmaco? Cosa si vedrà alla fine della RT-PCR?
161/162
Come si verifica l’ espressione del gene A153 nei diversi organi del topo tramite retrotrascrizione, PCR ed elettroforesi su gel? Cosa indicano la banda positiva e la banda negativa nel gel?
162
In base a cosa la fase di Plateau viene raggiunta prima o dopo? Cosa cambia relativamente all’ osservazione del grafico (cicli PCR-prodotto DNA) se l’obiettivo è apprezzare l’ espressione o meno di un gene, rispetto ad apprezzare le differenze di espressione di un gene?
162
Se l’obiettivo nella PCR è apprezzare le differenze di espressione di un gene cosa bisogna leggere e che strumento si utilizza?
163
Cos’ è il SYBR Green, per cosa viene sfruttato nella qRT-PCR? In che fase ha senso leggere la sua fluorescenza?
163
Quando è possibile vedere la fluorescenza per la prima volta in un termociclatore? Cosa definisce questa soglia e che sigla si usa per indicare il numero di cicli di PCR necessari per raggiungerla? Cosa si intende invece con base-line?
164
Cosa significa nella qRT-PCR amplificare l’ espressione genica?
164
Quale è la differenza fra quantificazione relativa e quantificazione assoluta quando si parla di qRT-PCR?
164/165
Cos’ è il normalizzante della quantificazione relativa di qRT-PCR, quali sono in genere quelli che vengono scelti e che criterio si utilizza per sceglierli? Che tipo di problema risolvono nell’ esperimento?
165
Perché è utile la normalizzazione del campione nella qRT-PCR?
165-166
Cosa permette di intuire il threshold cycle nella qRT-PCR?
166
Come viene utilizzata la qRT-PCR nel test molecolare per infezione virale e quali conclusioni vengono tratte?
166
Come viene utilizzata la qRT-PCR nel monitoraggio della malattia minima residuo?
166
Su cosa si basa la digital PCR?
167
Quali sono quattro esempi di applicazione cliniche della PCR e su cosa si basano?
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