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Cours H2021 > Protéines cours 8 - Techniques immunologiques (Martin) > Flashcards

Protéines cours 8 - Techniques immunologiques (Martin) Flashcards

1
Q

Quelle molécule est marquée dans un dosage compétitif et non compétitif? (immunoessais pour doser un analyte, pas un Ab)

A
  • Compétitif : Ag*
  • Non-compétitif : Ab*
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Q

Vrai ou faux : Les méthodes immunométriques sont des immunoessais qui utilisent 2 Ab dans la méthode

A

VRAI

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Q

Quelle est la différence entre un immunoessais en phase homogène et en phase hétérogène?

A

Phase homogène :

  • Phase liquide
  • Aucune séparation requise
  • Plus rapide
  • Plus facile à automatiser

Phase hétérogène :

  • Phases solide/liquide
  • Étapes de séparation du complexe immun marqué du marqueur libre
    • Lavage
    • Précipitation
  • Plus long
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4
Q

Vrai ou faux : Les immunoessais compétitifs ont toujours une relation inversement proportionnelle

A

FAUX

TRÈS majoritairment inversement proportionnel, mais pas toujours

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5
Q

Quel est le principe d’un radioimmunoessai (RIA)?

A

Utilisation d’un isotope radioactif pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ac-Ab

  • Courbe réponse : % de lié sur total (inversement prop)
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6
Q

Quels sont les avantages du RIA?

A

Avantages RIA :

  • Meilleure sensibilité analytique que la néphélométrie
  • Peu d’effet de HIL sur le signal
  • Marquage a peu d’effet sur les molécules
    • Ab conserve son immunoréactivité lorsque marqué
    • Ag est faiblement altéré par le marquage radioactif
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7
Q

Quels sont les désavantages du RIA?

A

Désavantages RIA :

  • Phase hétérogène requise (séparation nécessaire)
  • Réactifs instables (t1/2 des radioisotopes)
  • Surveillance étroite de la courbe d’étalonnage
    • Validation biochimiste
    • Hétéroscédasticité
  • Technique manuelle
    • répétitif : blessures techno
    • Formation
    • Délai de réponse
    • Retrait préventif
  • Permis et mesures de radioprotection
    • Gestion des radioisotopes (déchets, stockage, …)
  • Besoin d’un compteur gamma
  • Alternativec non-isotopiques encouragées (ALARA)
    • Fournisseurs ont abandonné trousses
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8
Q

Qu’est-ce que l’hétéroscédasticité (immunoessais)?

A

CV variable le long de la courbe réponse

  • EN opposition avec homoscédasticité : même précision, même SD sur toute la courbe
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9
Q

Quel est le principe analytique d’un dosage immunoenzymatique (EIA)?

A

Méthode qui utilise la propriété catalytique d’une enzyme pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ab-Ag

  • Des conjugués stables Ab-Enzyme ou Ag-Enzyme doivent être préparés sans altérer la réactivité immunologique
  • Production d’un signal via l’activité enzymatique du marqueur
    • Production d’un produit détectable par photométrie
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10
Q

Nommer les marqueurs enzymatiques les plus utilisés pour les immunoessais enzymatiques (EIA)

A
  • Horse Radish Peroxidase
  • Phosphatase alcaline
  • Bêta-galactosidase
  • Glucose-6-phosphate déshydrogénase
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11
Q

Nommer 3 types de dosage immunoenzymatique (EIA)

A
  • CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay
    • bêta-galactosidase
    • Homogène
  • EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique
    • Glucose-6-phosphate déshydrogénase
    • Homogène
  • ELISA : Enzyme-linked immunosorbent Assay
    • Hétérogène
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12
Q

Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais EMIT

A

EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique

  • Un Ag est marqué avec une enzyme
    • Lorsque Ag* lié à Ab (Ag*-Ab), l’enzyme n’a pas d’activité (aucun signal)
    • Lorsque l’analyte est présent (Ag), il y a compétition et libération de Ag* de Ab lié. Production de signal
    • Signal inversement proportionnel
  • Méthode en phase homogène
  • Méthode compétitive

*Surtout utilisé pour dosage Rx et dépistage drogues de rue (urine)

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13
Q

Nommer quelques avantages et inconvénients de la méthode EMIT (immunoessais)

A

Avantages :

  • S’adapte aux analyseurs de chimie générale (photométrie)
  • Fabrication peu couteuse
  • Largement utilisée

Désavantages :

  • Dosage limité aux petites molécules (Rx, stéroïdes, vitamines)
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14
Q

Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais CEDIA

A

CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay

  • L’enzyme est en 2 fragments. Elle devient active lorsque les 2 fragments sont réunis
    • bêta-galactosidase ou phosphatase alcaline
    • 1 fragment est lié à Ag (ED-Ag)
    • Si ED-Ag est lié à un Ab, pas de signal
    • Analyte compétitionne avec ED-Ag pour Ab.
  • Signal directement proportionnel [analyte]
  • Méthode homogène compétitive

*Méthode possible grâce au génie génétique (clonage)

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15
Q

Quel est le principe et les caractéristiques d’un ELISA?

A

2 principes possibles :

  1. Ab lié à support solide et Ag* compétitionne avec analyte. (COMPÉTITIF)
  2. Ag lié à support solide (via Ab) et utilisation d’un Ab* (formation d’un sandwich, NON-COMPÉTITIF)

Dans tous le cas, c’est un immunoessais hétérogène

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16
Q

Nommer quelques avantages et inconvénients des ELISA

A

Avantages :

  • Essais adaptés aux immuno-analyseurs à haute cadence

Désavantage :

  • essai hétérogène : Plus long!
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17
Q

Vrai ou faux : Les méthodes photométriques sont plus sensible que les méthodes non-chromogéniques (fluorescence, chimiluminescence)

A

FAUX

Chimiluminescence et fluorescence parmi les méthodes de détection des plus sensibles!

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18
Q

Qu’est-ce que la luminescence?

A

Phénomène d‘émission de photons à partir d’un atome ou d’une molécule dans un état électronique excité. En retournant à son état fondamental à partir de son état excité, l’énergie perdue se transforme en photon

  • Bioluminescence : É produite par rxn enzym dans des organismes vivants
  • Chimiluminescence : É est apportée par une rxn chimique exothermique
  • Photoluminescence : É provient de l’absorption de photon (inclu fluorescence et phosphorescence)
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19
Q

Quel est le principe d’un immunoessai immunofluorescent (FIA)?

A

Utilisation d’un marqueur fluorescent pour détecter et quantifier la réaction immunologique (Ab-Ag)

  • Fluorophore est excité à une longueur d’onde donnée (courte et énergétique) et réémet à une longueur d’onde plus longue et moins énergétique
  • Méthode en phase homogène
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20
Q

Nommer des fluorphores pouvant être utilisés en immunofluorescence

A
  • Fluorescéine
  • Rhodamine
  • Europium
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21
Q

Nommer 2 méthodes d’immunofluorescence utilisées en immunoessais

A
  1. Fluorescence polarisée (FPIA)
  2. Time-resolved fluorescence
22
Q

Quels sont le principe et les caractéristiques des dosages FPIA?

A

FPIA : Fluorescent polarisation immunoassay

  • Mesure d’émission de fluorescence polarisée lorsque fluorophore excité avec lumière polarisée
    • Ag* (*=fluorophore) seul = fluorescence non-polarisée (rotation libre)
    • Ag*+Ab=Ag*-Ab : Émission de fluorescence polarisée (rotation lente)
  • Analyte compétitionne avec Ag* pour Ab
  • Signal inversement proportionnel [analyte]
  • Méthode compétitive homogène
23
Q

Quel est le principe d’un dosage en immunochimiluminescence?

A

Utilisation d’un marqueur chimiluminescent pour détecter et quntifier la réacrtion immunologique (Ag-Ab)

24
Q

Nommer 2 marqueurs utilisés en immunochimiluminescence

A
  • Ruthénium
  • Ester d’acridinium
25
Q

Quel est le principe et les caractéristiques de la méthode ECLIA?

A

ECLIA : Electrochimiluminescence immunoassay

  • Immunoessais hétérogène non-compétitif
  • 2 Ab spécifiques à Ag : Formation d’une sandwich
  • Liaison à un support solide (billes magnétiques avec streptavidine)
    • “quasi-homogène”
  • Complexe immun concentré vers une électrode (particule paramagnétique) : oxydation du * et Émission lumière
    • Ruthénium émet de la lumière

(!) Aussi possible d’être compétitif

26
Q

Quel est le principe et les caractéristiques d’un immonoessai LOCI?

A

LOCI : Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay

  • Homogène non compétitif
  • 2 Ab qui reconnaissent Ag
    • 1 Ab lié à une particule “sensibilisateur”
    • 1 Ab lié à une particule chimiluminescente
  • Lorsque particules sensibilisateur et chimiluminescente à proximité via liaison Ab:Ag:Ab, signal luminescent
    • Irradiation UV pour produire oxygène singulet
    • O2 singulet active particule chimiluminescente et produit chimiluminescence (mesurée)
      • Directement proportionnel
27
Q

Quel système de pontage est largement utilisé dans l’architecture de plusieurs techniques immunologiques pour fixer l’Ab ou l’Ag* à un support solide?

A

Biotine-streptavidine

28
Q

Vrai ou faux : La biotinylation des protéines ou des petites molécules ne change pas ou très peu leur activité biologique et leur immunoréactivité

A

VRAI

29
Q

Pourquoi la normalisation des méthodes de dosage est-elle importante?

A

La normalisation est importante pour :

  • Évaluer et suivre la concentration d’un constituant A chez un patient dans n’importe quel labo
30
Q

Quelles sont les difficultés auxquelles nous faisons face et qui limitent la normalisation des méthodes de dosage?

A
  • Conditions pré-analytiques différentes
  • Appareils différents
  • Principes d’analyse différents
  • VR différentes
  • Unités de meure différentes
31
Q

Pourquoi faut-il normaliser les méthodes de dosage (s’harmoniser)?

A
  • Traçabilité métrologique
  • Justesse de mesure
  • Accréditation
  • Comparabilité des résultats et des VR
  • Guides de pratique cliniques (seuils de décision médicale)
  • Sécurité des Ptx
  • Confiance du public
  • Harmonisation SIL et DSQ
32
Q

Que devrait-on harmoniser dans nos laboratoires?

A
  • Protocoles de laboratoire
  • Technologie, traçabilité et commutabilité
  • Prélèvement, stabilisation et conservation des éch
  • Rapport d’analyse et transmission des résultats
  • Nom des tests
  • Unités, VR, Vc
33
Q

Qu’est-ce que la traçabilité métrologique?

A

Propriété d’un résultat de mesure selon laquelle ce résultat peut être relié à une référence (étalon international, matériel de référence) par l’intermédiaire d’une chaîne ininterrompus et documentée d’étalonnages sont chacun contribue à l’incertitude de mesure

  • Chaine de traçabilité métrologique : Succession d’étalons et d’étalonnages qui est utilisée pour relier un résultat de mesure à une référence
34
Q

Qu’est-ce qu’un matériel de référence?

A

Matériau dont les propriétés physiques et/ou chimiques sont suffisamment bien déterminées pour permettre son utilisation dans :

  • Étalonnage des instruments
  • Validation des méthodes
  • Assignation de valeurs (fabricants)
  • Évaluation de la comparabilité de résultats
35
Q

Qu’est-ce qu’un matériel de référence certifié?

A

Matériel de référence certifié : Matériel de référence accompagné d’une documentation délivrée par un organisme faisant autorité et fournissant une ou plusieurs valeurs de propriétés spécifiées avec les incertitudes et les traçabilités associées

36
Q

Qu’est-ce que la commutabilité d’un matériau de référence?

A

Propriété d’un matériau de référence qui indique dans quelle mesure le matériau imite les caractéristiques d’échantillons cliniques typiques dans les procédures de mesure pour un mesurande indiqué

**Même justesse que s’il s’agit d’un échantillon patient (pour avoir confiance en nos contrôles!)

**CQi/e doivent être commutables aux échantillons patients!

37
Q

Nommer des substances interférentes endogènes pour les immunoessais

A
  • Hémolyse
  • Ictère
  • Lipémie
  • Ab et Auto-Ab anti-analyte
  • Protéine de liaison
  • Ab hétérophiles
  • HAAA : Ab humaine anti-animaux
  • Réactivité croisée (molécules apparantées)
38
Q

Nommer des substances interférentes exogènes pour les immunoessais

A
  • Additifs ajoutés aux échantillons en cours d’analyse
  • Ab administrés aux Ptx (Tx)
  • Rx
  • Suppléments alimentaires et produits naturels
  • Substances radioactives ou fluorescentes présentes dans l’échantillon
  • Rémanence (carryover)
  • Additifs utilisés dans la fabrication des tubes de prélèvements
39
Q

Vrai ou faux : L’effet crochet est une interférence qui peut arriver avec tous les types d’immunoessais

A

FAUX

  • Essais immunométriques (non-compétitifs)
  • Néphélémétrie
  • Turbidimétrie
40
Q

Que sont les Ab hétérophiles?

A

Ab qui réagissent contre différentes parties de l’Ab réactif de la méthode immunologique (faible affinité)

  • Ab naturels ou auto-immuns
41
Q

Qu’est-ce qu’un Ab idiotypique?

A

Ab qui reconnait la partie Fab de l’Ab de la méthode

  • Interférence avec la partie des sites de liaison à l’Ag
42
Q

Quels types d’ab hétérophiles peuvent causer des interférences?

A
  • Facteur rhumatoïde
  • Ab itiodype
  • Ab anti-animaux
43
Q

Quel est le mécanisme d’interférence causé par les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux?

A
  • Peuvent interférer en créant un pont entre l’Ab de capture et l’Ab marqué (fausse augmentation)
  • Peuvent interférer en neutralisant un ou les 2 Ab empêchant leur réaction (fausse diminution)
44
Q

Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (blocage de l’interférence)

A

Ab anti-animaux :

  • Interférence plus facile à bloquer
  • Ajouter aux réactifs des protéines sériques de même source animale que celle des Ab

Ab hétérophiles :

  • Interférences plus difficiles à bloquer
  • Ab peuvent réagir avec plusieurs types d’Ab
45
Q

Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (provenance/origine)

A

Ab anti-animaux :

  • Ab spécifiques produits chez des individus après une exposition à des préparations d’origine animale ou suite à un contact prolongé avec des animaux

Ab hétérophiles :

  • Ab naturels non spécifiques présents chez tous les individus
  • Certains types sont associés à des maladies auto-immunes
46
Q

Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (spécificité/affinité)

A

Ab anti-animaux :

  • Ab dirigés spécifiquement contre les protéines d’espèce animale en cause
  • Affinités élevées
  • Peuvent interférer dans tous les types d’IE

Ab hétérophiles :

  • Ab de faible affinité
  • Généralement pas spécifiques
  • Interfèrent surtout dans les Ie de type immunométriques
47
Q

Quelle est la fréquence estimée des Ab hétérophiles?

A

Environ 0,05%. Peut être plus, peut être moins

  • Dépend aussi de la population/clientèle de l’hôpital
    • Ex : beaucoup de maladie auto-immune, hopital en région avec des agriculteurs…
48
Q

Comment détecter une interférence?

A
  • Dépister l’erreur
    • Résultat incohérent avec la clinique (CLINICIEN)
    • Dilutions sériées qui ne concordent pas (LABO)
    • Différente avec une autre technique
  • Confirmer le bon résultat
    • Résultat alternatif conforme à la clinique
  • Éliminer l’interférence
    • Techniques physiques ou agents bloquants
      • *Certaines compagnies ont déjà des agents bloquants dans leur préparation
49
Q

Comment éliminer les interférences hétérophiles?

A
  • Par élimination des Ab avant dosage
    • Ultracentri
    • Chauffage 90°C
    • PEG
  • Par blocage non-spécifique des Ab pendant le dosage
    • Globulines non immunes
    • Sérum animal (> 2 espèces)
    • Dilution sériées avec sérum animal
  • Par blocage spécifique des Ab pendant le dosage
    • Ig anti Ab hétérophile et HAMA
    • IgG monoclonales de souris anti IgM humaines
50
Q

Nommer des interférences possibles avec le système indicateur (sinal) en IE

A
  • Radioactivité dans le spécimen
  • Augmentaiton pathologique de l’enzyme utilisée dans un EIA (Ex : PAL)
  • Ab anti-ruthénium
  • Substances fluorescentes ou atténuantes en FIA
  • Substances atténuantes dans les CIA
51
Q

Discuter de l’interférence de la biotine avec les dosages hormonaux

A

Biotine exogène peut interférer avec le système de détection utilisant la liaison biotine-streptavidine

  • Interférences peuvent causer des profils pathologiques!
    • TSH dosée en sandwich. Biotine = fausse diminution du signal. Signal directement proportionnel. TSH diminuée
    • T4L dosée en compétitif. Biotine = fausse diminution du signal. Signal inversement proportionnel. T4L augmentée
    • Dx d’hyperthyroïdie crée par une interférence à la biotine!!!
52
Q

Quelles sont les utilisations pharmacologiques de la biotine?

A
  • Déficience génétique en biotinidase
  • Maladies métaboliques mitochondriales
  • Crampes chez les hémodialysés
  • Sclérose en plaque évolutive
  • Syndromes de malabsorption
  • Nutrition parentérale totale

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