Protéines cours 8 - Techniques immunologiques (Martin) Flashcards
1
Q
Quelle molécule est marquée dans un dosage compétitif et non compétitif? (immunoessais pour doser un analyte, pas un Ab)
A
- Compétitif : Ag*
- Non-compétitif : Ab*
2
Q
Vrai ou faux : Les méthodes immunométriques sont des immunoessais qui utilisent 2 Ab dans la méthode
A
VRAI
3
Q
Quelle est la différence entre un immunoessais en phase homogène et en phase hétérogène?
A
Phase homogène :
- Phase liquide
- Aucune séparation requise
- Plus rapide
- Plus facile à automatiser
Phase hétérogène :
- Phases solide/liquide
- Étapes de séparation du complexe immun marqué du marqueur libre
- Lavage
- Précipitation
- Plus long
4
Q
Vrai ou faux : Les immunoessais compétitifs ont toujours une relation inversement proportionnelle
A
FAUX
TRÈS majoritairment inversement proportionnel, mais pas toujours
5
Q
Quel est le principe d’un radioimmunoessai (RIA)?
A
Utilisation d’un isotope radioactif pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ac-Ab
- Courbe réponse : % de lié sur total (inversement prop)
6
Q
Quels sont les avantages du RIA?
A
Avantages RIA :
- Meilleure sensibilité analytique que la néphélométrie
- Peu d’effet de HIL sur le signal
- Marquage a peu d’effet sur les molécules
- Ab conserve son immunoréactivité lorsque marqué
- Ag est faiblement altéré par le marquage radioactif
7
Q
Quels sont les désavantages du RIA?
A
Désavantages RIA :
- Phase hétérogène requise (séparation nécessaire)
- Réactifs instables (t1/2 des radioisotopes)
- Surveillance étroite de la courbe d’étalonnage
- Validation biochimiste
- Hétéroscédasticité
- Technique manuelle
- répétitif : blessures techno
- Formation
- Délai de réponse
- Retrait préventif
- Permis et mesures de radioprotection
- Gestion des radioisotopes (déchets, stockage, …)
- Besoin d’un compteur gamma
- Alternativec non-isotopiques encouragées (ALARA)
- Fournisseurs ont abandonné trousses
8
Q
Qu’est-ce que l’hétéroscédasticité (immunoessais)?
A
CV variable le long de la courbe réponse
- EN opposition avec homoscédasticité : même précision, même SD sur toute la courbe
9
Q
Quel est le principe analytique d’un dosage immunoenzymatique (EIA)?
A
Méthode qui utilise la propriété catalytique d’une enzyme pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ab-Ag
- Des conjugués stables Ab-Enzyme ou Ag-Enzyme doivent être préparés sans altérer la réactivité immunologique
- Production d’un signal via l’activité enzymatique du marqueur
- Production d’un produit détectable par photométrie
10
Q
Nommer les marqueurs enzymatiques les plus utilisés pour les immunoessais enzymatiques (EIA)
A
- Horse Radish Peroxidase
- Phosphatase alcaline
- Bêta-galactosidase
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase
11
Q
Nommer 3 types de dosage immunoenzymatique (EIA)
A
-
CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay
- bêta-galactosidase
- Homogène
-
EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase
- Homogène
-
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent Assay
- Hétérogène
12
Q
Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais EMIT
A
EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique
- Un Ag est marqué avec une enzyme
- Lorsque Ag* lié à Ab (Ag*-Ab), l’enzyme n’a pas d’activité (aucun signal)
- Lorsque l’analyte est présent (Ag), il y a compétition et libération de Ag* de Ab lié. Production de signal
- Signal inversement proportionnel
- Méthode en phase homogène
- Méthode compétitive
*Surtout utilisé pour dosage Rx et dépistage drogues de rue (urine)
13
Q
Nommer quelques avantages et inconvénients de la méthode EMIT (immunoessais)
A
Avantages :
- S’adapte aux analyseurs de chimie générale (photométrie)
- Fabrication peu couteuse
- Largement utilisée
Désavantages :
- Dosage limité aux petites molécules (Rx, stéroïdes, vitamines)
14
Q
Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais CEDIA
A
CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay
- L’enzyme est en 2 fragments. Elle devient active lorsque les 2 fragments sont réunis
- bêta-galactosidase ou phosphatase alcaline
- 1 fragment est lié à Ag (ED-Ag)
- Si ED-Ag est lié à un Ab, pas de signal
- Analyte compétitionne avec ED-Ag pour Ab.
- Signal directement proportionnel [analyte]
- Méthode homogène compétitive
*Méthode possible grâce au génie génétique (clonage)
15
Q
Quel est le principe et les caractéristiques d’un ELISA?
A
2 principes possibles :
- Ab lié à support solide et Ag* compétitionne avec analyte. (COMPÉTITIF)
- Ag lié à support solide (via Ab) et utilisation d’un Ab* (formation d’un sandwich, NON-COMPÉTITIF)
Dans tous le cas, c’est un immunoessais hétérogène
16
Q
Nommer quelques avantages et inconvénients des ELISA
A
Avantages :
- Essais adaptés aux immuno-analyseurs à haute cadence
Désavantage :
- essai hétérogène : Plus long!
17
Q
Vrai ou faux : Les méthodes photométriques sont plus sensible que les méthodes non-chromogéniques (fluorescence, chimiluminescence)
A
FAUX
Chimiluminescence et fluorescence parmi les méthodes de détection des plus sensibles!
18
Q
Qu’est-ce que la luminescence?
A
Phénomène d‘émission de photons à partir d’un atome ou d’une molécule dans un état électronique excité. En retournant à son état fondamental à partir de son état excité, l’énergie perdue se transforme en photon
- Bioluminescence : É produite par rxn enzym dans des organismes vivants
- Chimiluminescence : É est apportée par une rxn chimique exothermique
- Photoluminescence : É provient de l’absorption de photon (inclu fluorescence et phosphorescence)
19
Q
Quel est le principe d’un immunoessai immunofluorescent (FIA)?
A
Utilisation d’un marqueur fluorescent pour détecter et quantifier la réaction immunologique (Ab-Ag)
- Fluorophore est excité à une longueur d’onde donnée (courte et énergétique) et réémet à une longueur d’onde plus longue et moins énergétique
- Méthode en phase homogène
20
Q
Nommer des fluorphores pouvant être utilisés en immunofluorescence
A
- Fluorescéine
- Rhodamine
- Europium
21
Q
Nommer 2 méthodes d’immunofluorescence utilisées en immunoessais
A
- Fluorescence polarisée (FPIA)
- Time-resolved fluorescence
22
Q
Quels sont le principe et les caractéristiques des dosages FPIA?
A
FPIA : Fluorescent polarisation immunoassay
- Mesure d’émission de fluorescence polarisée lorsque fluorophore excité avec lumière polarisée
- Ag* (*=fluorophore) seul = fluorescence non-polarisée (rotation libre)
- Ag*+Ab=Ag*-Ab : Émission de fluorescence polarisée (rotation lente)
- Analyte compétitionne avec Ag* pour Ab
- Signal inversement proportionnel [analyte]
- Méthode compétitive homogène
23
Q
Quel est le principe d’un dosage en immunochimiluminescence?
A
Utilisation d’un marqueur chimiluminescent pour détecter et quntifier la réacrtion immunologique (Ag-Ab)
24
Q
Nommer 2 marqueurs utilisés en immunochimiluminescence
A
- Ruthénium
- Ester d’acridinium
25
Quel est le principe et les caractéristiques de la méthode ECLIA?
**ECLIA** : Electrochimiluminescence immunoassay
* Immunoessais **hétérogène non-compétitif**
* 2 Ab spécifiques à Ag : Formation d'une sandwich
* Liaison à un support solide (billes magnétiques avec streptavidine)
* "quasi-homogène"
* Complexe immun concentré vers une électrode (particule paramagnétique) : oxydation du \* et Émission lumière
* Ruthénium émet de la lumière
***(!) Aussi possible d'être compétitif***
26
Quel est le principe et les caractéristiques d'un immonoessai LOCI?
**LOCI** : Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay
* **Homogène non compétitif**
* 2 Ab qui reconnaissent Ag
* 1 Ab lié à une particule "sensibilisateur"
* 1 Ab lié à une particule chimiluminescente
* Lorsque particules sensibilisateur et chimiluminescente à proximité via liaison Ab:Ag:Ab, signal luminescent
* Irradiation UV pour produire oxygène singulet
* O2 singulet active particule chimiluminescente et produit chimiluminescence (mesurée)
* Directement proportionnel
27
Quel système de pontage est largement utilisé dans l'architecture de plusieurs techniques immunologiques pour fixer l'Ab ou l'Ag\* à un support solide?
Biotine-streptavidine
28
_Vrai ou faux :_ La biotinylation des protéines ou des petites molécules ne change pas ou très peu leur activité biologique et leur immunoréactivité
**VRAI**
29
Pourquoi la normalisation des méthodes de dosage est-elle importante?
La normalisation est importante pour :
* Évaluer et suivre la concentration d'un constituant A chez un patient dans n'importe quel labo
30
Quelles sont les difficultés auxquelles nous faisons face et qui limitent la normalisation des méthodes de dosage?
* Conditions pré-analytiques différentes
* Appareils différents
* Principes d'analyse différents
* VR différentes
* Unités de meure différentes
31
Pourquoi faut-il normaliser les méthodes de dosage (s'harmoniser)?
* Traçabilité métrologique
* Justesse de mesure
* Accréditation
* Comparabilité des résultats et des VR
* Guides de pratique cliniques (seuils de décision médicale)
* Sécurité des Ptx
* Confiance du public
* Harmonisation SIL et DSQ
32
Que devrait-on harmoniser dans nos laboratoires?
* Protocoles de laboratoire
* Technologie, traçabilité et commutabilité
* Prélèvement, stabilisation et conservation des éch
* Rapport d'analyse et transmission des résultats
* Nom des tests
* Unités, VR, Vc
33
Qu'est-ce que la traçabilité métrologique?
Propriété d'un résultat de mesure selon laquelle ce r**ésultat peut être relié à une référence (étalon international, matériel de référence)** par l'intermédiaire d'une **chaîne ininterrompus** et documentée d'étalonnages sont chacun contribue à l'**incertitude de mesure**
* _Chaine de traçabilité métrologique_ : Succession d'étalons et d'étalonnages qui est utilisée pour relier un résultat de mesure à une référence
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Qu'est-ce qu'un matériel de référence?
Matériau dont les propriétés physiques et/ou chimiques sont suffisamment bien déterminées pour permettre son utilisation dans :
* Étalonnage des instruments
* Validation des méthodes
* Assignation de valeurs (fabricants)
* Évaluation de la comparabilité de résultats
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Qu'est-ce qu'un matériel de référence **certifié**?
Matériel de référence certifié : Matériel de référence accompagné d'une documentation délivrée par un organisme faisant autorité et fournissant une ou plusieurs valeurs de propriétés spécifiées avec les incertitudes et les traçabilités associées
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Qu'est-ce que la **commutabilité** d'un matériau de référence?
Propriété d'un matériau de référence qui **indique dans quelle mesure le matériau imite les caractéristiques d'échantillons cliniques typique**s dans les procédures de mesure pour un mesurande indiqué
\*\*Même justesse que s'il s'agit d'un échantillon patient (pour avoir confiance en nos contrôles!)
\*\*CQi/e doivent être commutables aux échantillons patients!
37
Nommer des substances interférentes endogènes pour les immunoessais
* Hémolyse
* Ictère
* Lipémie
* Ab et Auto-Ab anti-analyte
* Protéine de liaison
* Ab hétérophiles
* HAAA : Ab humaine anti-animaux
* Réactivité croisée (molécules apparantées)
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Nommer des substances interférentes exogènes pour les immunoessais
* Additifs ajoutés aux échantillons en cours d'analyse
* Ab administrés aux Ptx (Tx)
* Rx
* Suppléments alimentaires et produits naturels
* Substances radioactives ou fluorescentes présentes dans l'échantillon
* Rémanence (carryover)
* Additifs utilisés dans la fabrication des tubes de prélèvements
39
Vrai ou faux : L'effet crochet est une interférence qui peut arriver avec tous les types d'immunoessais
**FAUX**
* Essais immunométriques (non-compétitifs)
* Néphélémétrie
* Turbidimétrie
40
Que sont les Ab hétérophiles?
Ab qui réagissent contre différentes parties de l'Ab réactif de la méthode immunologique (faible affinité)
* Ab naturels ou auto-immuns
41
Qu'est-ce qu'un Ab idiotypique?
Ab qui reconnait la partie Fab de l'Ab de la méthode
* Interférence avec la partie des sites de liaison à l'Ag
42
Quels types d'ab hétérophiles peuvent causer des interférences?
* Facteur rhumatoïde
* Ab itiodype
* Ab anti-animaux
43
Quel est le mécanisme d'interférence causé par les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux?
* Peuvent interférer en créant un pont entre l'Ab de capture et l'Ab marqué (fausse augmentation)
* Peuvent interférer en neutralisant un ou les 2 Ab empêchant leur réaction (fausse diminution)
44
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (blocage de l'interférence)
**_Ab anti-animaux :_**
* Interférence plus facile à bloquer
* Ajouter aux réactifs des protéines sériques de même source animale que celle des Ab
**_Ab hétérophiles :_**
* Interférences plus difficiles à bloquer
* Ab peuvent réagir avec plusieurs types d'Ab
45
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (provenance/origine)
**_Ab anti-animaux :_**
* Ab spécifiques produits chez des individus après une exposition à des préparations d'origine animale ou suite à un contact prolongé avec des animaux
**_Ab hétérophiles :_**
* Ab naturels non spécifiques présents chez tous les individus
* Certains types sont associés à des maladies auto-immunes
46
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (spécificité/affinité)
**_Ab anti-animaux :_**
* Ab dirigés **spécifiquement** contre les protéines d'espèce animale en cause
* **Affinités élevées**
* Peuvent interférer dans **tous les types d'IE**
**_Ab hétérophiles :_**
* Ab de **faible affinité**
* Généralement **pas spécifiques**
* Interfèrent surtout dans les Ie de type **immunométriques**
47
Quelle est la fréquence estimée des Ab hétérophiles?
**Environ 0,05%**. Peut être plus, peut être moins
* Dépend aussi de la population/clientèle de l'hôpital
* Ex : beaucoup de maladie auto-immune, hopital en région avec des agriculteurs...
48
Comment détecter une interférence?
* Dépister l'erreur
* Résultat incohérent avec la clinique (CLINICIEN)
* Dilutions sériées qui ne concordent pas (LABO)
* Différente avec une autre technique
* Confirmer le bon résultat
* Résultat alternatif conforme à la clinique
* Éliminer l'interférence
* Techniques physiques ou agents bloquants
* *\*Certaines compagnies ont déjà des agents bloquants dans leur préparation*
49
Comment éliminer les interférences hétérophiles?
* Par **élimination** des Ab avant dosage
* Ultracentri
* Chauffage 90°C
* PEG
* Par blocage **non-spécifique** des Ab pendant le dosage
* Globulines non immunes
* Sérum animal (\> 2 espèces)
* Dilution sériées avec sérum animal
* Par blocage **spécifique** des Ab pendant le dosage
* Ig anti Ab hétérophile et HAMA
* IgG monoclonales de souris anti IgM humaines
50
Nommer des interférences possibles avec le système indicateur (sinal) en IE
* Radioactivité dans le spécimen
* Augmentaiton pathologique de l'enzyme utilisée dans un EIA (Ex : PAL)
* Ab anti-ruthénium
* Substances fluorescentes ou atténuantes en FIA
* Substances atténuantes dans les CIA
51
Discuter de l'interférence de la biotine avec les dosages hormonaux
Biotine exogène peut interférer avec le système de détection utilisant la liaison biotine-streptavidine
* Interférences peuvent causer des profils pathologiques!
* TSH dosée en sandwich. Biotine = fausse diminution du signal. Signal directement proportionnel. TSH diminuée
* T4L dosée en compétitif. Biotine = fausse diminution du signal. Signal inversement proportionnel. T4L augmentée
* **Dx d'hyperthyroïdie crée par une interférence à la biotine!!!**
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Quelles sont les utilisations pharmacologiques de la biotine?
* Déficience génétique en biotinidase
* Maladies métaboliques mitochondriales
* Crampes chez les hémodialysés
* Sclérose en plaque évolutive
* Syndromes de malabsorption
* Nutrition parentérale totale
