PCR + ANA

Question 1

Vad är skillnaden mellan realtidsPCR och vanlig PCR?

Answer 1

Man kan mäta mängden av en viss målsekvens i en realtidsPCR, det kan man ej göra i vanlig

Question 2

Vad är en indirekt metod respektive en direkt metod inom infektionsdiagnostik?

Answer 2

Indirekt metod - Man påvisar inte själva bakterien i sig utan något som tyder på att bakterien är där, tex antikroppar

Direkt metod - man påvisar det man vi påvisa direkt, tex mikroskop

Question 3

Nämn två indirekta metoder och tre direkta metoder

Answer 3

Indirekta: serologi och klinisk bild

Direkta: Mikroskopi, molekylärdiagnostik och odling

Question 4

Vad finns det för olika metoder för att påvisa antikroppar?

Answer 4

ELISA, IFA, immunoblot

Question 5

Nämn för- och nackdelar med serologi, mikroskopi, odling och molekylärdiagnostik

Answer 5

Serologi

• enkel, snabb, billig
• Risk för korsreaktioner, svårt att särskilja på aktiva och föregående infektioner

Mikroskopi
Fördel
- Hitta nya agens
Nackdel
- Avancerad teknisk utrustning, tränad personal, okänslig

Odling

• Starkt bevis för infektion
• Långsam, okänslig

Molekylärdiagnostik

• Snabb, känslig
• Kan inte särskilja på levande och dött

Question 6

Vad måste man göra innan man börjar med en PCR?

Answer 6

1. Lysera/förstöra celler
2. Rena fram nukleinsyror
3. Tillägg av nödvändiga agens

Question 7

Vad innehåller PCR-blandningen?

Answer 7

• DNA-templat(det DNA vi vill undersöka)
• Två eller fler primers
• DNA-byggstenar
• Buffert
  DNA-polymeras

Question 8

Vad finns det för tre faser under PCR?

Answer 8

Denaturering
Annealing
Extension

Question 9

Varför pågår inte en exponentiell ökning av DNA, där det fördubblas efter varje cykel, för evigt?

Answer 9

Taq-polymeraset blir “trött”

Det blir exponentiellt svårare att hitta primers och nukleotider

Question 10

Vilka tre faser finns det under DNA-amplikationen om man sätter antalet PCR-cykler som funktion för antalet kopior DNA?

Answer 10

Exponentiell - Fördubbling av PCR-produkt varje cykel

Linjär - PCR-produkten fördubblas inte längre varje cykel

Platå - Reaktionen har avstannat: inga mer produkter produceras

Question 11

Vad är ett Ct- värde? Hur fungerar det och vad kan man använda det till?

Answer 11

Ct-värde kan man säga är ett värde på hur stor koncentrationen av målsekvensen var från början. Desto mer av målsekvensen vi har i ett prov desto snabbare kommer den komma upp i större mängd kopior vid en mindre mängd cykler. Genom att sätta ett tröskelvärde som är samma så vet vi att desto tidigare lägre Ct-värdet är (alltså desto mindre cykler) desto större är koncentratinen från början.

Om man jämför Ct-värdet med en standardkurva kan man få fram vad koncentrationen var från början.

Question 12

Vad innebär reaktionseffektivitet?

Answer 12

Hur mycket vårt målsekvens som fördubblas vid varje cykel. 100 % motsvarar en dubbel ökning, vanligtvis kommer man bara upp i 95%.

Question 13

Hur mäter vi egentligen DNA?

Answer 13

Vi använder reagenser som fluorescerar vid närvaro av amplifierat DNA

Question 14

Vad finns det för olika realtidsPCR-system?

Answer 14

SYBR-Green

Taq-Man

Question 15

Hur fungerar SYBR-Green och smältkurvsanalys?

Answer 15

SYBR-Green fungerar genom att den har DNA-bindande fluoroforer som binder in till all dubbelsträngat DNA, dvs alla produkter som Taq-polymeraset skapar, på detta sättet kan man sedan mäta fluorescensen. Enda problemet är att fluoroforerna binder till allt dubbelsträngat DNA vilket ger en risk för kontamination.

Då kan man göra en smältkurvsanalys vilket går ut på att man upphettar DNA:t så att det faller sönder vilket gör att i takt med att mer DNA faller sönder desto mer minskar fluorescensen. När den minskar som mest plottar man sedan upp mot vad temperaturen är. Temperaturen är specifik och man kan på så sätt identifiera vad det är för bakterie det är och om det förefallit kontamination.

Question 16

Vad finns det för fördelar och nackdelar med SYBR-Green?

Answer 16

Fördelar
- Billig, känslig, enkel design, smltkurvsanalys

Nackdelar
- Ospecifik (detekterar allt dubbelsträngat DNA (alla PCR-produkter)

Question 17

Hur fungerar Taq-Man?

Answer 17

Detta systemet bygger på att vi har specifika prober som binder in till enkelsträngat DNA. Proberna har en fluorofor och en quencher (gör så att fluoroforen inte emitterar ljus så länge dom är tillräckligt nära varandra).

Dessa binder in till enkelsträngat DNA under annelingfasen och när Taq-polymeraset sedan jobbar kommer det att förstöra proben. Detta gör att både quenchern och fluoroforen frisätts vilket innebär att fluoroforen börjar fluorescera då den inte är hämmad av quenchern. Mängden fluorescens är direkt proportionell mot mängden DNA i lösningen.

Question 18

Vad finns det för fördelar och nackdelar med Taq-Man?

Answer 18

Fördelar

• Mer specifik
• Multiplex

Nackdelar

• Dyr
• Svårare design
• Ingen smältkurvsanalys

Question 19

Vad är ANA?

Answer 19

Antikroppar mot många olika antigener i cellkärnor (antinuclear antibodies)

Question 20

Vilka olika ANA-mönster finns det när man tittar med immunofluorescens-mikroskopi? Vilka celler tittar man på?

Answer 20

Man kollar på en vilande och en delande cell. Dom olika mönstrena som finns är:

• Homogen
• Kornig
• Centromer
• Nukleolär

Question 21

När ska en analys av ANA beställas?

Answer 21

Vid misstanke om inflammatorisk systemsjukdom eller utredning av oklar leverpåverkan

Question 22

Hur analyseras ANA?

Answer 22

1. IF-mikroskopi
2. ELISA
3. Immuno-blot

Question 23

Vad är HEp-2?

Answer 23

Odlade humana epitelceller som används som “targetceller” vid ANA. Det är dessa som man tillsätter patientens plasma till

Question 24

Vad tyder ett positivt test för ett homogent mönster på? Vad har vi antikroppar mot?

Answer 24

Att vi har antikroppar mot kromatin-associerade antigener. Kan vara dubbelsträngat DNA, histoner eller nukleosomer

Question 25

Om man får ett positivt test för ett homogent mönster och vill se om antikropparna är riktade mot dsDNA, hur gör man då?

Answer 25

Man tillsätter patientens serum till ett glas där man har specifika flagellater (crithidia luciliae). Får man en reaktion så vet man att man har ak mot dsDNA

Question 26

Vad tyder ett positivt test för ett kornigt mönster på? Vad har vi antikroppar mot?

Answer 26

Det tyder på att vi har antikroppar mot extrakromosomala kärnantigener såsom:
snRNP
SS-A/SS-B
Scl-70

Question 27

Vad tyder ett positivt test för ett nukleolärt mönster på? Vad har vi antikroppar mot?

Answer 27

Tyder starkt för systemisk skleros. Vi har antikroppar mot:
Fibrillarin
RNA-polymera-1
PM-Scl
SS-B

Question 28

Vad tyder ett positivt test för ett centromert mönster på? Vad har vi antikroppar mot?

Answer 28

Tecken på att vi har antikroppar mot centromerer såsom:

CENP- A, B och C

Question 29

Vad är en cut-offgräns vid ANA och varför har man detta?

Answer 29

Cut-offgräns används för att bestämma om ett ANA test är patologiskt eller inte. Friska personer har inte alltid ett negativt ANA utan beroende på hur mycket man späder ut provet kommer andelen ANA som är positiva att variera. Därför har man satt en viss gräns vid en viss spädningsnivå så att man får det mest optimala testet.

Question 30

Vilket är det enda som man kan använda vid aktivitetsmarkör när det gäller ANA?

Answer 30

anti-dsDNA vid SLE, resten är bara markörer för infalmmatoriska systemsjukdomar och autoimmuna leversjukdomar