IMMUNO FONDAMENTALE - I. 15 - Méthodes utilisant les réactions Ag/Ac

Question 1

Réaction Ag/Ac

• définition
• application
• mise en évidence

Answer 1

DEFINITION

• association entre le paratope de l’anticorps et l’épitoge de l’antigène : nécessite une bonne complémentarité stérique
• réaction réversible : associée à une constance d’affinité Ka en L/M

APPLICATIONS
Détection/dosage d’un Ag : méthodes dont il faut vérifier la spécificité, la sensibilité et la reproductibilité
- identification d’une cellule, d’un agent infectieux
- dosage d’une protéine, d’une hormone, d’un médicament

MISE EN EVIDENCE/TITRAGE D’UN AC
On déficit une valeur seuil du rapport signal/bruit au-dessus de laquelle la réaction est considérée positive.
- diagnostic et suivi sérologique d’une infection
- sérologies bactériennes, virales, parasitaires
- contrôle de vaccination
- diagnostic et suivi sérologique d’une maladie auto-immune, d’une allergie
- suivi de grossesse

Question 2

Immunoprécipitation

Answer 2

IMMUNOPRECIPITATION
- Elle se fait en milieu liquide ou gélosé entre un antigène soluble et un anticorps précipitant (IgM, IgG) → formation d’un complexe Ag/Ac insoluble = réseau macromoléculaire
Cette technique nécessite ;
• un Ac au moins bivalent (2 paratopes) : seuls les sérums polyclonaux donnent des réactions de précipitation. Donc le dosage d’un fragment Fab n’est pas possible avec cette technique.
• un Ag au moins bivalent (2 épitopes) : le dosage d’un haptène (un seul épitope) n’est donc pas possible avec cette technique sauf s’il est couplé à une protéine porteuse.

On introduit des antigènes en quantité constante dans des tubes et on ajoute des quantités croissantes d’anticorps : formation d’un précipité (réseau macromoléculaire) atteignant à une certaine dilution, un zone d’équivalence. En dehors de cette zone d’équivalence, on est soit en excès d’anticorps, soit en excès d’antigènes.

Question 3

Immunonéphélémétrie et immunoturbidimétrie

Answer 3

Il s’agit d’une technique basée sur les propriétés de déviation de la lumière d’un rayon laser par des complexes immuns en milieu liquide. C’est une technique de dosage d’un Ag ou d’un Ac. l’un des réactifs est à concentartion constante (concentration en Ag constante pour un dosage d’Ac et inversement)

Cette technique est quantitative et nécessite une gamme d’étalonnage pour obtenir la concentration de la molécule à doser.
Si la concentration d’anticorps correspond à celle d’antigène, un trouble apparait.

→ Turbidimétrie : mesure du rayonnement absorbé
→ Néphélémétrie : mesure du rayonnement diffusé

Question 4

IMMUNOELECTROPHORESE

Answer 4

Technique qualitative en 2 temps

• séparation des protéines dans un gel d’agarose, sous l’action du champ électrique selon leur charge et leur MM
• révélation grâce à un sérum animal immunisé spécifique (comportant des Ac : se trouvent tout au long d’une rigole et vont reconnaitre les antigènes là où ils auront migré)

Chaque zone d’équivalence correspondant à un précipité Ag-Ac se traduit par un arc de précipitation. Cette méthode est utilisée pour détecter les composants monoclonaux dans le sérum.

Question 5

Technique d’OUchterlony (immunodiffusioin double)

Answer 5

Sur gel d’agarose, l’Ag est déposé au centre et les sérums sont déposés dans des puits percés autour, à distance les uns des autres.
→ on impose un courant électrique et les molécules diffusent de manière homogène dans le gel en fonction de leur taille.
→ lorsqu’un complexe Ag/Ac se crée, il se forme une ligne de précipitation dans le gel.

Question 6

Immunofixation

Answer 6

Dans un premier temps a lieu la séparation d’une solution antigénique par électrophorèse puis, dans un second temps, un Ac spécifique est déposé à la surface du gel. Il pénètre dans le gel et précipite par formation d’un réseau avec l’antigène.

Un lavage est réalisé puis les complexes sont colorés par un colorant de protéines. Méthode plus rapide et plus sensible que l’immunoélectrophorèse pour la détection des immunoglobulines monoclonales.

Question 7

Immunodiffusion radiale = technique de Mancini

Answer 7

Elle consiste à incorporer un antisérum spécifique dans la gélose puis à déposer le sérum dans les puits.
A l’équilibre, il y a formation d’un anneau de précipitation dont le carré du diamètre est proportionnel à la concentration en Ag.
Une gamme étalon est réalisée avec un Ag en concentration connue utilisée pour déduire la concentration en Ag dans le sérum.

Question 8

Immunoagglutination

Answer 8

Cette technique est basée sur l’interaction entre les anticorps agglutinant spécifiques (IgM, IgG) et un antigène sur un élément figuré (érythrocyte, bactérie, particule) → agglutination visibles à l’oeil nu. Les IgM sont plus agglutinants que les autres classe d’Ig.

→ Agglutination directe
Cette technique est réalisable si l’Ac est directement agglutinant (cas des IgM). Elle permet de rechercher des Ag présents en surface de la particule.
• Technique utilisée pour la détermination des groupes sanguins (épreuve de Beth-Vincent) : recherche des Ag présents à la surface des hématies grâce à un sérum de référence.

 •  Technique utilisée pour le séro-diagnostic de la fièvre typhoïde

→ Agglutination passive
Cette technique est réalisée avec un Ag soluble qui est fixé sur un élément figuré (hématies, billes de latex etc…). La présence des Ac est détectée par agglutinations particules sur lesquelles l’Ag est fixé.
Cette technique est utilisée par exemple dans le dosage du TPHA, la détection des facteurs rhumatoïdes, ou le test de Coombs.

Exemple d’agglutination passive indirecte : Coombs indirect
Cette technique est utilisée pour rechercher un Ac non agglutinant (Ac anti-Th). On utilise alors un Ac antiglobuline qui provoque l’agglutination.

La réaction a lieu en 2 temps

1) les hématies Rh+ sont mises en présence du sérum à tester (fixation des Ac anti-Rh s’ils son présents)
2) Ajout de l’anti globuline = anti-IgG humaine, ce qui provoque l’agglutination si le sérum contient des Ac anti-Rh.

Question 9

Immunomarquage

Answer 9

• Avec un fluorochrome = immunofluorescence
• Avec un enzyme
• Avec un radio-isotope, qui permet un comptage de la radioactivité avec un spectromètre γ. L’antigène ou l’anticorps est marqué, la mesure du signal est faite au sein du complexe anticorps/antigène. La plupart de ces méthodes de dosage comportent une étape intermédiaire de lavage pour éliminer les antigènes et anticorps non complexés.

IMMUNOFLUORESCENCE

• directe si l’anticorps est dirigé contre la molécule d’intérêt
• indirecte si un anticorps monoclonal (dit primaire) reconnait la molécule d’intérêt et un second Ac couplé au fluorochrome est dirigé contre l’anticorps primaire
• la lecture se fait par microscopie à fluorescence.

IMMUNOENZYMOLOGIE
Un enzyme est fixé sur l’anticorps = anticorps conjugué (peroxydase, phosphatase alcaline)
Après addition du substrat, la réaction libère un produit coloré ou fluorescent. La lecture se fait à l’oeil ou avec un spectrophotomètre.

 •  ELISA indirect Dosage d'un anticorps spécifique : un Ag est fixé à un support, lors de l'ajout du sérum, si l'Ac recherché est présent, il reconnaît l'Ag ; un Ag secondaire couplé à une enzyme est ensuite ajouté, il reconnaît l'anticorps primaire, enfin le substrat est ajouté et le produit de la réaction observé.

 •  ELISA sandwich Dosage d'un antigène en solution : en Ac (dit de capture) est fixé à un support, le sérum contenant l'Ag recherché est ajouté. Enfin on ajoute un Ac conjugué à un enzyme puis le substrat et on observe le produit de la réaction, à l'oeil nu ou avec un spectrophotomètre.

 •  IMMUNOEMPREINTE Cette technique permet la détection de protéines présentes dans un échantillon biologique. Les étapes sont  - séparation des protéines selon leur MM et leur taille sous l'action d'un champ électrique - transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose - la membrane est incubée avec un Ac spécifique de la protéine d'intérêt (primaire) - ajout d'un Ac secondaire couplé à un enzyme - révélation de la réaction après ajout du substrat par colorimétrie.