HC 8.2: Diagnostiek van immunodeficiënties Flashcards
indeling van dit college:
- Typen immuundeficiënties: primaire immuundeficiënties (PID) en secundaire immuundeficiënties
- Diagnostisch proces van primaire immuundeficiënties: immunofenotypering (bloed en beenmerg) en DNA mutatie analyse
- Enkele voorbeelden van primaire immuundeficiënties
- Nieuw ontwikkelingen
primaire immuundeficiënties:
- “inborn errors of immunity”
- oorzaak immuundeficiëntie ligt bij het immuunsysteem zelf
- genetisch defect/afwijking in het immuunsysteem
- zeldzaam
- vaak één specifiek deel van het immuunsysteem aangedaan
–> deze ziekten geven meer inzicht in het functioneren van het immuunsysteem
secundaire immuundeficiënties:
- oorzaak van immuundeficiëntie ligt buiten het immuunsysteem
- meestal verworven
- vrij frequent
- meestal is het immuunsysteem diffuus aangedaan
–> meerdere functies gestoord
indeling primaire immuundeficiënties:
- bij het grootste deel, meer dan 50% van alle primaire immuundeficiënties, is er een probleem met de antistoffen
- ook een deel waarbij er problemen zijn met de T-cellen/T-cel deficiëntie
- fagocyten deficiëntie/problemen met de fagocyten
- er is ook een grote groep van goed gedefinieerde PID’s, maar waarbij meerdere celtypen zijn aangedaan/bij betrokken zijn
- deficiënties in het complement systeem
- auto-immuun problemen door disregulatie van het immuunsysteem
- auto-inflammatoire problemen/syndromen
- ongeclassificeerde PID’s
er zijn meer dan 500 genen geïdentificeerd, waarvan we weten dat als in dat gen een foutje zit, kan dat problemen leiden van het immuunsysteem. er zijn dus specifieke Candidate genen, die wanneer er een fout in optreedt, geassocieerd worden met specifieke PID’s.
de RAG1 en RAG2 eiwitten geven, wanneer daar mutaties in optreden, vroege blokkade in de B- en T-cel ontwikkeling
terwijl als er sprake is van een interferon-gamma deficiëntie, gaat er iets mis bij de interactie tussen macrofagen (fagocyterende cel) en T-helper cellen.
–> je ziet dus dat er meerdere moleculen in zo’n systeem een rol spelen en als 1 van die moleculen uitvalt, dan heb je al een probleem
symptomen van immuundeficiënties:
- infecties
- auto-reactiviteit (auto-antistoffen, auto-immuunziekten)
- granuloomvorming
- tumoren (vooral maligne lymfomen en leukemieën)
–> maar we zien tegenwoordig dat infecties niet meer de belangrijkste factor zijn bij immuundeficiënties. de extra complicaties (dus de auto-reactiviteit, granuloomvorming en tumoren) bepalen veel meer de prognose.
de prognose van patiënten met een immuundeficiëntie zijn dus zeker ook gerelateerd aan zulk soort extra complicaties
bij het diagnostische proces van PID’s nemen we de klinische presentatie als uitgangspunt. je gaat gericht testen inzetten, aan de hand van de klinische presentatie en de DD/vermoedens die je daarbij hebt gevormd.
als het klinische beeld van een PID er is, dan kan je aan de hand daarvan een aantal dingen doen om snel in beeld te krijgen wat er afwijkend is. je kan naar de immuunglobulines gaan kijken, dus dan wil je gewoon weten of er uberhaupt plasmacellen zijn die immuunglobulines produceren.
een andere manier om te kijken is middels flowcytometrische analyse. daarmee kijk je wat er met cellen aan de hand is.
10 warning signs of primary immunodeficiency: (geldt vooral voor kinderen)
1: 4 of meer nieuwe oor infecties binnen 1 jaar
2: 2 of meer ernstige sinus infecties binnen 1 jaar
3: 2 of meer maanden van antibiotica gebruik met weinig effect
4: 2 of meer longontstekingen in 1 jaar
5: falen van een zuigeling om aan te komen en afwijkende groei
6: terugkerende diepe huid of orgaan abcessen
7: persisterende spuw in de mond of schimmeld infecties op de huid
8: noodzaak om intraveneuze antibiotica te geven om een infectie te klaren
9: 2 of meer diep gewortelde infecties, including sepsis
10: familie geschiedenis/anamnese van PID
nog meer warning signs die niet in dat rijtje van 10 staan:
- bronchiectasieën eci
- therapieresistente astma
- infecties op ongebruikelijke plaatsen
- onverwachte verwekkers
- ernstig of langdurig beloop
- recidiverende infectie met dezelfde verwekker
- consanguiniteit
- karakteristieke uiterlijke kenmerken
als er dus van dat soort warning signs zijn bij de klinische presentatie, dan is de volgende stap:
om diagnostische testen in te zetten.
dat begint dus vaak met het bepalen van de spiegels van de immuunglobulinen.
en daarnaast dus inventarisatie van de cellen middels flowcytometrie.
flowcytometrie vervult meerdere rollen in de PID diagnostiek:
- analyse van aantallen lymfocyten (T/B/NK)
–> “zijn bepaalde celtypen uberhaupt aanwezig? of zijn er bijvoorbeeld helemaal geen B-cellen?” - analyse van eiwitexpressie en/of acitiviteit
- analyse voorloper B-celdifferentiatie/perifere B-cel subsets
analyse van aantallen lymfocyten:
- absolute aantallen B-, T-, NK-lymfocyten
- hierbij kijk je naar bloed, met flowcytometrie
- je zoemt hierbij in op marker CD45 (marker voor de witte bloedcellen)
- en vervolgens binnen die groep van CD45 positieve cellen, naar andere markers
- je kijkt dan naar CD3+ en CD3-, je krijgt dan dus 2 populaties
- en die populaties kan je nog verder uitsplitsen
- zo kan je de CD3+ populatie splitsen in CD4 en CD8 positieve cellen, de SP, DP en DN
–> hiermee kan je dus op een vrij simpele manier in kaart brengen of deze verschillende celtypen aanwezig zijn
–> het is hierbij wel belangrijk dat je je realiseert dat op basis van de leeftijd, verschillende absolute waarden als normaalwaarden ziet. de hoeveelheid van deze cellen kan met de leeftijd variëren. er zijn normaalwaarden, afhankelijk van de leeftijd, waarmee je de uitslagen dus vergelijkt.
afwezigheid van T, B en/of NK subsets:
- hier een paar voorbeelden hiervan, toegepast op SCID (Severe Combined Immune Deficiency)
- als je middels flowcytometrie en die markers, de cellen ‘indeelt’ in populaties
- dan zie je dat er soms populaties missen, dat er subsets missen
- als er bijvoorbeeld nauwelijks tot geen B-cellen of T-cellen zijn, maar wel NK cellen, dan noemen we dat een T- B- SCID
- maar het kan ook zo zijn dat er nauwelijks tot geen T-cellen zijn, maar wel B-cellen en NK-cellen, dan is er sprake van een T- B+ SCID
–> hiermee kan je dus al snel vaststellen of er iets ernstigs aan de hand is
T-cel defecten kunnen gepaard gaan met NK-cel afwezigheid of aanwezigheid. en ook met de aanwezigheid of afwezigheid van B-cellen. en op basis van de combinatie van die cellen en hun aan- of afwezigheid, kan je eigenlijk al tot de Candidate/kandidaat genen komen die mogelijk het probleem veroorzaken en daar dus gericht genetisch onderzoek naar doen.
ZIE OOK PLAATJE IN WORD!
je kan ook wat subtieler gaan kijken, dus niet alleen naar de hele cel, maar voornamelijk kijken naar de eiwitten in zo’n cel.
dus analyse van eiwitexpressie en/of acitiviteit:
- je kan middels markers bepalen welke eiwitten er aan- of afwezig zijn in specifieke cellen
- je kan dus ook de eiwitactiviteit testen in een cel (ook middels flowcytometrie)
analyse voorloper B-celdifferentiatie/perifere B-cel subsets:
- de B-cel differentiatie gebeurt op 2 plekken, namelijk in het beenmerg en in het bloed en de lymfatische weefsels
- aan de hand van labelling, kun je op basis van een combinatie van moleculen (bijv. CD10, CD20 en CD19) kunnen we die voorstadia zien en dus naar de ontwikkelingsstadia van die B-cellen kijken
- je kan dus op die manier kijken naar de verdeling van voorloper B-cel compartimenten in het beenmerg. en aan de hand van normaalwaardes van die verdeling bepalen of er een probleem in het beenmerg zit
analyse van B-cel subsets in het bloed:
- we kunnen dus die voorloper B-cellen bekijken en onderscheiden, dus B-cellen die zich vroeg in de ontwikkeling bevinden
- maar we kunnen ook kijken naar cellen die al wat verder ontwikkeld zijn
- we kijken dan naar B-cellen die net het beenmerg uitkomen, naïeve mature B-cellen, maar ook B-cellen die door de kiemcentrumreactie geactiveerd worden en uiteindelijk geheugencellen of plasmacellen worden
- we kunnen die cellen allemaal in kaart brengen in het bloed
- we kunnen dan kijken of er genoeg geheugencellen zijn
- of er niet te veel transitionele B-cellen zijn (de cellen die net uit het BM komen)
- en of er genoeg plasmacellen zijn
—> je kan hierbij afwijkende patronen zien die kunnen passen bij een specifieke CVID
- flowcytometrie kan helpen om heel grof in kaart te brengen of cellen aanwezig of afwezig zijn
- maar flowcytometrie is ook geschikt om wat specifieker/subtieler te kijken naar de verdeling van die cellen en om te kijken of die cellen zich misschien wat minder goed ontwikkelen, om op die manier een idee te krijgen waar de fout zich bevindt
- en je kan dus aan de hand van eiwitexpressie of eiwitactiviteit analyse, of individueel molecuulniveau kijken wat er aan de hand is
je hebt dan een basis om de volgende stap te maken: genetische analyse
–> soms is flowcytometrische analyse genoeg om te weten wat er aan de hand is en om een behandeling te starten. maar toch is genetische analyse heel relevant
relevantie van identificatie genetisch defect in PID patiënten:
- geeft exacte (moleculaire) diagnose
- legt basis voor adequate behandeling en prognose
- biedt moeglijkheid voor lange-termijn preventiestrategie, ter beperking van complicaties en irreversibele orgaanschade
- draagt bij aan therapietrouw en biedt mogelijkheden voor genetic counseling
- is een vereiste voor gentherapie
fluorescent sequencen van PCR producten:
- je kan het gen van interesse gaan bekijken door het te amplificeren
- je moet daarbij kijken naar de coderende delen van het genetische materiaal
- je gaat dus eerst met een PCR reactie de exonen amplificeren
- vervolgense sequencen we de PCR producten
- tijdens die sequensen gebruiken we nucleotiden die een fluorescent label hebben
- aan de hand van die labels kun je dus de sequentie aflezen (ZIE PLAATJE IN WORD!!)
- en de resultaten van de volgorde van de sequentie kan je vervolgens vergelijken met referentie sequenties uit een genoom database
verschillende typen mutaties:
- Puntmutaties (veranderingen van één nucleotide):
- silent mutatie: geen aminozuur verandering
- missense mutatie: aminozuur verandering
- nonsense mutatie: stopcodon - Splice site mutaties: bevinden zich in het grensgebied van het exon en het intron
- Kleine deleties en inserties: deleties of inserties van één of enkele nucelotiden leiden tot verandering van de aminozuurvolgorde
- Grote deleties: kunnen worden aangetoond met PCR of met Southern blotting
typische presentatie van een patiënt met BTK gen mutatie, dus X-gebonden Agammaglobulinemie (XLA):
klinische presentatie:
- vanaf ~3maanden na geboorte veel infecties met pyogene bacteriën
immunologische afwijkingen:
- serumconcentraties IgG, IgM en IgA zeer sterk verlaagd
- geen B-cellen in het bloed
- in lymfeklier: nauwelijks follikels en geen of weinig plasmacellen
- normale cellulaire immuniteit (d.w.z. afweer tegen virussen en schimmels is grotendeels ongestoord)
genetisch defect:
- mutatie in het BTK gen
–> dus X-gebonden agammaglobulinemie
2e casus van een PID, een typische presentatie van SCID:
klinische presentatie:
- jongen van 5 maanden oud
- slecht gedijen, aanhoudende problematiek (diarree, infecties zowel viraal als bacterieel)
- ICU opname voor pneumonie veroorzaakt door Pneumocystitis jiroveci (= een gist)
- broer van moeder overleden op jonge leeftijd
immunologische afwijkingen:
- wel B-cellen, geen T-cellen en geen NK-cellen
–> en dat valt dus onder de categorie SCID (dus afwezigheid van functionele T-cellen in combinatie met gestoorde B-cel functie
–> je komt dan uit in de categorie T-B+NK-, en dan zijn er een paar opties van genen die hier de oorzaak voor zijn, namelijk: IL2RG (X-gebonden) en JAK3
–> en aangezien het om een jongen gaat is de kans groot dat het IL2RG mutatie is, en dat was ook zo
therapie SCID in casus 2:
hemtopoietische stamcel transplantatie (eventueel gentherapie overwegen)
SCID en betrokken genen:
- T-B-NK+ : RAG1, RAG2 of Artemis
- T-B+NK+ : bv IL7RA, CD3 ketens
- T-B-NK- : ADA
- T-B+NK- : IL2RG, JAK3
bij patiënten met hetzelfde defect in een gen, hoeft de klinische presentatie niet gelijk te zijn.
zelfde gen, andere effecten
belang van genetische analyse, is dat we vroegere diagnoses kunnen stellen. en vroege diagnose heeft een veel hogere kans op overleving, doordat er veel minder schade heeft kunnen ontstaan.
tegenwoordig hebben we neonatale screening voor SCID middels de hielprikscreening.
samenvatting van het college/diagnostische proces bij PID:
- Klinisch en immunologisch in kaart brengen van de patiënt (stapsgewijs diagnostisch protocol bij vermoeden van afweerstoornis)
- Flowcytometrisch onderzoek van bloed en beenmerg (gericht onderzoek naar afweercellen en hun eiwitten + zijn alle cellen en eiwitten normaal aanwezig?)
- DNA diagnostiek van de mogelijk gemuteerde genen (gericht onderzoek van PID genen om mutaties op te sporen (evt selectie van genen op basis van flowcytometrie) + genetic counseling/prenatale diagnostiek)
