HC 1.6 HLA, kruisproeven en allocatie Flashcards
Waarom matchen we HLA?
- Overleving van orgaan of van patiënt
o Hoe meer mismatches hoe lager de overall survival bij stamceltransplantatie. Bij solide transplantaties komen de curves overeen maar gaat het over de overleving van het orgaan. - Bij stamceltransplantatie is er een tweede reden voor matching, namelijk het voorkomen van graft vs host disease.
Op welk chromosoom ligt het HLA en in welke twee klassen in het in te delen?
HLA ligt op chromosoom 6 en is op te delen in 2 klassen. Klasse 1 en klasse 2. Bij HLA klasse 1 kijken we bij transplantatie naar A, B en C, bij HLA klasse 2 kijken we naar DR, DQ en DP.
Klasse 1 komt tot expressie op alle kernhoudende lichaamscellen, klasse 2 komt eigenlijk alleen voor op immuuncellen.
Hoe komt het HLA aan zijn nomenclatuur?
- Eerste veld is de allelgroep: kan bijvoorbeeld A2, A3 of A1 zijn. Dan weet je in hoofdlijnen hoe het eiwit eruit ziet.
- Het tweede veld is nodig om in meer detail te weten hoe het eiwit eruit ziet (HLA protein).
- Het derde veld betekend dat er geen verschil zit tussen het HLA eiwit maar dat er wel verschil zit tussen de DNA sequentie (synonymous mutation within coding region).
- Het vierde veld gaat over mutaties buiten de coderende regio, dit kan van invloed zijn op de expressie van het gen.
Het voorbeeld met de N erachter betekend dat het hele HLA eiwit niet tot expressie komt.
Waarom is HLA-matching lastig?
- 25% kans op HLA match bij broertje of zusje.
- Er is een stijging van gevonden HLA-allelen, dus er zijn meer verschillende allelen wat het matchen moeilijk maakt (Het HLA-allel is polymorf).
- Vanwege overerving binnen de familie, als je een minder voorkomend haplotype hebt is het dus lastig om een match te vinden.
Voor wat voor donor gaan we altijd bij SCT?
We gaan altijd bij SCT voor een 10/10 donor of een identiek familielid.
Waarom is HLA matching belangrijk?
- verhoogt overleving van patiënt
- verlaagt kans op afstoting
- verhoogt overleving van het orgaan
Eventueel zou je ook nog kunnen onderbouwen dat het het risico op infecties verlaagd omdat hoe beter je match, hoe minder immunosuppressie je nodig hebt. Dus minder kans op infectie.
Hoeveel verschillende HLA moleculen zijn er?
35.000
Welke factoren bepalen het succes van NTx?
HLA typering, etniciteit, ontbreken van HLA antistoffen, welke indicatie voor NTx, bloedgroep, donorkarakteristieken (o.a. leeftijd, levend/overleden donor, ischemietijd).
Waarom is HLA matching bij transplantatie belangrijk?
Elke mismatch meer leidt tot een snellere afstoting van het orgaan.
Waarom is HLA matching niet het allerbelangrijkste?
HLA matching is belangrijk, maar niet het allerbelangrijkste. Want hierdoor kunnen er mensen zijn die nooit een match vinden en dat is ethisch niet verantwoord.
Wat kan zorgen voor een acuut rejectierisico?
Bloedgroepantistoffen of HLA antistoffen.
Wat zijn de twee immunologische doelen bij transplantatie?
- Match bloedgroep
- Best mogelijke match voor
- HLA klasse I (A, B)
- HLA klasse II (DRB1)
Ontwijken HLA antistoffen (A, B, C, DRB1, DRP1, DRQ1)
Wat zijn de donoropties bij transplantatie?
- Levende donors: familie, vrienden, altruïsten
- Postmortale donors: via Eurotransplant (AM, ETKAS)
Wat is eurotransplant?
Eurotransplant is een samenwerking van 8 Europese landen, alle patiënten komen op één wachtlijst. Voordeel is dat je het aanbod van donoren vergroot. 20% van de patiënten gaat de grens over.
Hoe werkt het als er bijvoorbeeld een potentiële nierdonor is? Naar welk programma gaat het dan?
Op het moment dat er een potentiële nierdonor is, wordt er gekeken wat de leeftijd van de donor is. Is de patiënt 65+ dan naar het ESP programma. Is de patiënt < 65, dan wordt eerst gekeken of de patiënt kan worden aangeboden in het AM programma (patiënten met veel HLA antistoffen), daarna in het ETKAS programma.
Wat is het puntensysteem voor de allocatie ETKAS?
Point score system (donor 18-65 yr)
1. AM patiënten of AM patiënten via desensibilisatieprogramma
2. 000-MM (rank o.b.v. score)
3. Rest van de patiënten
- HLA-A, B, DR matching : max punten 400 (800 voor kinderen)
- Mismatch probability: max 100 punten
- Waiting time (per year) : max 33.3 punten
- Distance factor : max 300 punten
- National balance : no max
- HU/Kidney after liver /kidney donor : 500
Wanneer kun je vreemd HLA tegenkomen?
Vreemd HLA tegenkomen: bloedtransfusie, eerdere transplantatie, zwangerschap, dus hierdoor kunnen er HLA antistoffen ontwikkeld worden.
Wat zijn de gevolgen van het hebben van HLA-antistoffen?
HLA-matchen is al moeilijk, maar er komen dan antistoffen bij en dit maakt het vinden van de geschikte donor lastiger.
HLA-antistoffen verhoogd het risico op graft loss.
Waar kan DSA tot leiden?
DSA (donor specifieke antilichamen) kunnen leiden tot:
- Acute humorale rejectie
- Chronisch transplantaatfalen
Wat doen we in het lab?
- HLA typering (van de patiënt en de donor)
- HLA antistofscreening (om te kijken of de patiënt geen acute rejectie gaat ontwikkelen)
- Kruisproeven
- Donor search
Hoe doen we HLA typering en matching?
HLA match nodig voor ET allocatie (patiënt & donor)
- HR typering patiënt (hoge resolutie), LR typering donor (lage resolutie)
- Matching op HLA-A, HLA-B en HLA-DRB1
- Bij antistoffen kijken we ook naar C, DQ en DP
Welke DNA typeertechnieken zijn er voor HLA typering?
Lage resolutie
1) Sequence specific priming (SSP): mbv primers – kan in 2-3 uur
2) Sequence specific oligonucleotides (SSO): mbv oligonucleotide (luminex
Hoge resolutie
3) Sequence-based typing (SBT)
- Gene sequencing (Sanger and NGS)
- Toekomst nanosequencing kan binnen 6-8 uur, dus dit zou in de toekomst ook gebruikt kunnen worden in post-mortale setting.
Hoe kan HLA antistofscreening worden gedaan?
- Complement dependent cytotoxicity (CDC)
- Luminex-based assays
HLA antistofscreening is nodig voor toelating op de wachtlijst. Daarna moet het elk kwartaal worden herhaald, de antistofscreening is 150 dagen houdbaar.
Hoe werkt CDC?
- Serum van de ontvanger: Het serum van de ontvanger, dat antilichamen kan bevatten gericht tegen specifieke HLA-antigenen, wordt verzameld.
- Panelcellen met bekende HLA-typering: Een reeks panelcellen met bekende HLA-typering, die verschillende HLA-antigenen tot expressie brengen, wordt voorbereid. Deze cellen worden gekweekt in een laboratorium en hebben bekende HLA-profielen.
- Incubatie van serum met panelcellen: Het serum van de ontvanger wordt gemengd met de panelcellen die HLA-antigenen tot expressie brengen waar mogelijk antilichamen tegen zijn. Als het serum antilichamen bevat die specifiek gericht zijn tegen de HLA-antigenen op de panelcellen, zullen deze antilichamen zich binden aan de overeenkomstige HLA-antigenen op de cellen.
- Toevoeging van complement: Nadat het serum met de panelcellen is gemengd, wordt complement (een onderdeel van het complementsysteem) toegevoegd aan het mengsel.
- CDC-reactie observeren: Als het serum antilichamen bevat die gebonden zijn aan de HLA-antigenen op de panelcellen, zal het complementsysteem geactiveerd worden door deze antilichaam-antigeenbinding. Dit kan leiden tot de vorming van het membraan-aanvalcomplex (MAC) op de cellen waar de antilichamen aan gebonden zijn.
- Cytotoxiciteit en celsterfte: Als reactie op de vorming van het MAC, kunnen de cellen beschadigd raken en uiteindelijk afsterven door celdood, wat kan worden waargenomen onder een microscoop of door het meten van bepaalde markers voor celsterfte.
Hoe werken luminex-based assays?
- Kralen met HLA-antigenen: In een Luminex-gebaseerde HLA-antistofscreening worden microscopisch kleine kralen gebruikt, elk met een uniek HLA-antigeen aan hun oppervlak gebonden. Deze kralen dragen verschillende HLA-antigenen die representatief zijn voor een breed scala aan mogelijke donorantigenen.
- Serum van de ontvanger: Het serum van de ontvanger, dat potentiële antilichamen tegen HLA-antigenen kan bevatten, wordt voorbereid en gemengd met de kralen met HLA-antigenen.
- Incubatie en binding: Tijdens de incubatie zullen eventuele antilichamen tegen HLA-antigenen in het serum van de ontvanger zich binden aan de overeenkomstige HLA-antigenen op de kralen.
- Detectie met fluorescentie: Na het wassen om ongebonden materialen te verwijderen, worden de kralen gemeten met behulp van een Luminex-instrument. Het instrument detecteert de fluorescentie op elke kralenpopulatie, wat aangeeft welke HLA-antilichamen gebonden zijn aan welke kralen.
- Kwantificatie en analyse: De fluorescentie-intensiteit wordt geanalyseerd met speciale software die de aanwezigheid en de relatieve hoeveelheid van HLA-antilichamen in het serum bepaalt. Dit geeft een gedetailleerd profiel van welke HLA-antilichamen aanwezig zijn en in welke concentraties.
Hoe werken kruisproeven?
Het serum van de patiënt wordt in contact gebracht met de donorcellen (bijvoorbeeld: de milt of bloed). Hierna wordt er een complement aan toegevoegd. Door het complementsysteem kan celdood optreden als gevolg van antilichaam-antigeenreacties tussen het serum van de ontvanger en de donor. Onder de microscoop kan de mate van celdood worden geëvalueerd, als er gelyseerde cellen onder de microscoop zichtbaar zijn –> positieve CDC kruisproef. Bij een positieve kruisproef is er 80% kans op een hyperacute reactie.
Kan ook met fluoriserende stoffen i.p.v. een complement. (flow kruisproef (FACS)).
Wanneer doen we kruisproeven?
- Altijd kruisen
- Kan ook retrospectief in sommige gevallen.
o Dit doen we bij patiënten die niet geïmmuniseerd (geen antistoffen) zijn of ‘ESP’ programma
o Screening nog ‘houdbaar’ (max. 150 dagen) en geen immunising events
o Als je niet voorafgaand moet kruisen dan is er minder koude ischemietijd. - Prospectief
o Geïmmuniseerde patiënt of nieuw serum
