Föreläsning Realtids PCR

Question 1

Vilka metoder finns det för att se antikroppar och antigener?

Answer 1

Serologi

• Detaktion av virusantikroppar
• Kan ej se aktiv infektion

ELISA
- Detektion av virusantigen eller dess antikropp med hjälp av antikroppar/ antigen

Immunoflourescense
- Antikroppar med “färger”

Question 2

Vilka molekylära metoder finns för att se virusgener?

Answer 2

Konventionell PCR

Realtids PCR

Microarray

Sekvensering

Question 3

Vilka övriga metoder, utöver molekylära metoder, finns för att se virus?

Answer 3

Elektronmikroskopi

Cellkulturer

Question 4

Rangordnade olika detektionsmetoder från specifictet (direktmetoder => indirekta metoder)

Answer 4

Högst specificitet:

1. Virusisolering
2. Genomdetektion
3. Antigendetektion
4. Serologi IgM
5. Serologi IgG

Question 5

qPCR = direktmetod, beskriv metoden!

Answer 5

Detektion och kvantifikation av gener hos virus
- Bra för att undersöka effekt av ex. antiviral behandling

Känsligare och ofta mer specifik än ELISA

Bästa metod för de flesta virus
- Känsligast

Nackdelar:

• Dyr
• Avancerad
• Känslig för kontamination
• Krävs att provet är tagit under eller nära akutfas (gäller ej kroniska tillstånd) innan infektionen går in i kovalensfasen

Question 6

Vad avgör vilken metod som ska användas?

Answer 6

Undersöks kronisk/ akut infektion?
- I kroniska tester ska man använda direkta test

Känslighet/ specificitet?

Resurser?

Question 7

ELISA =direktmetod, beskriv metoden

Answer 7

Fördelar: enkel, snabb och relativt billig

Nackdelar: känslighet, antigendrift

Question 8

Elektronmikroskopi = direktmetod, beskriv metoden

Answer 8

Bra för att hitta ovanliga virus där det ej finns andra test

Dålig pga kräver avancerad utrustning och tränad personal

Question 9

Vilken är standard för diagnostisering av virusinfektioner?

Answer 9

qPCR = real time PCR

Question 10

Vilka ingredienser krävs för PCR?

Answer 10

DNA-templat

2 eller fler primers

• komplementära till målsekvens man vill amplifiera
• primrar för att polymeraset behöver veta var man ska börja leta

Nukleosider

Buffrar

DNA-polymerase

Question 11

Vilka är faserna i en PCR-reaktion?

Answer 11

Exponentiell
- Fördubbling av PCR-produkt för varje cykel

Linjär
- PCR-produkt fördubblas ej längre

Platå
- Reaktion har avstannat

Question 12

Vad händer under en PCR och varför?

Answer 12

PRE-PCR

1. Lysera/ förstöra bakterier/virus
   - För att få fram deras RNA/ DNA
2. Rena fram nukleinsyror
3. Tillägg av nödvändiga reagens

PCR

• En liten mängd DNA kan ge en stor mängd DNA
  4. DNA amplifieras miljoner gånger

POST-PCR

• Verifiering av PCR-produkt
  5. Agarosgel och elektrofores

Question 13

Vad innebär real-time PCR?

Answer 13

Som en vanlig PCR, men man använder flouroscens för att se amplifikationssvar (via maskiner)

Amplifiering kan ses i realtid

Mäter mängden dna/ rna i exponentiell fas

Snabbt
- 30 min

Hög känslighet

Kan köra flera virus i samma mätning
- pga olika emissionsspektra

Skippar post-PCR-delen med elektrofores (tar lång tid)

Question 14

Varför är direkta metoder bättre än icke-direkta metoder (serologi)?

Answer 14

Serologi kan ej säga om positivt svar beror på:

• Pågående (kronisk) infektion
• Utläkt infektion
• Humoralt svar på vaccin

medan direkta metoder kan svara på detta

Question 15

Fungerar PCR om patogenen muterar?

Answer 15

Nej, en nackdel med PCR är att om bakterier muterar, ex. klamydia, krävs nya uppdaterade PCR-metoder

Virus muterar fort

• Ex. polio muterar på 5 dgr
• DNA-virus muterar långsammare