Bioch : Méthode de fractionnement

Question 1

Objectif d’un fractionnement ?

Answer 1

Obtenir une protéine purifiée/enrichie

Question 2

Pureté de la protéine pour usage thérapeutique ?

Answer 2

99%

Question 3

Pureté de la protéine pour cristallographie ?

Answer 3

95-99%

Question 4

Pureté d’un antigène pour production d’AC ?

Answer 4

< 95%

Question 5

Pourquoi faut-il limité les étape de purification ?

Answer 5

Pour perdre le moins possible de protéine et limiter les risques de dénaturation de celles-ci

Question 6

Condition pour réaliser une lyse des protéine ?

Answer 6

• Tampon d’extraction à pH adapté pour la prot : pKa dans la gamme du pH
  + PARFOIS
• Agents réducteurs
• Inhibiteur de protéase
• Glycérol
• Enzymes lytiques

Question 7

Technique d’extraction douce ?

Answer 7

• Choc osmotique
• Homogénéisateur / broyeur ( Dounce ou Potter)

Question 8

Techniques d’extraction brutales ?

Answer 8

• Presse Amico-french
• Cassage aux billes de verre
• Sonication

Question 9

Avantage de la presse Amico-french ?

Answer 9

On peut travailler à froid => 4°C pour éviter la dénaturation des protéines

Question 10

Inconvénient du cassage aux billes de verres ?

Answer 10

Augmentation de la T° importante

Question 11

Principe de la sonication ?

Answer 11

• Formation de bulle par cavitation
• Croissance et explosion des bulles
• Augmentation très importante de pression et T°
• Risque de dénaturation
• Besoin de refroidir régulièrement la solution

Question 12

Avantage et inconvénient de la centrifugation différentielle ?

Answer 12

A :
Etapes simple et rapide
I :
Apporte un faible degré de pureté

Question 13

Méthode de vérification du degrés de pureté ?

Answer 13

• Absorption dans l’UV
• Colorimétrie
  
  • Bradford
  • Biuret
  • Lowry
• Activité enzymatique
• Immuno-enzymatique (si enzyme)

Question 14

Propriétés des protéine utilisée pour la purification ?

Answer 14

• Masse moléculaire
• Forme
• Structure
• Charge
• Densité
• Hydrophobicité/solubilité
• Etiquetage

Question 15

Principe de la précipitation différentielle ?

Answer 15

Précipitation en fonction du pH

Question 16

Techniques de séparation en fonction de la densité de la protéine ?

Answer 16

• Isopycnique :
  
  • gradient de densité continu
  • gradient de densité discontinu
• Zonale (gradient continu)

Question 17

Principe de la focalisation isoélectrique ?

Answer 17

Variation du pH pour atteindre le point isoélectrique de la molécule (la où elle sera neutre)

Question 18

Principe de la résine échangeuse d’ion ?

Answer 18

• Mélange sur la résine chargé à l’opposé de la protéine => Affinité
• Pour récupérer les protéine, prendre un ion avec une affinité + forte pour la résine que la protéine ou changement de pH

Question 19

Principe de l’électrophorèse ?

Answer 19

Utiliser un courant électrique pour séparer les protéines avec variation de pH

Question 20

Principe de l’électrophorèse de type immuno-électrophorégramme ?

Answer 20

Couplage de l’électrophorèse avec une solution contenant des anticorps spécifiques

Question 21

Quelles sont les différentes techniques de purification qui se basent sur la taille de la protéine ?

Answer 21

• Filtration sur gel : tamis moléculaire
• Chromatophorèse SDS-PAGE

Question 22

Qu’est ce que la zone efficace (Filtration sur gel) ?

Answer 22

Située entre V et Vt sur le graphique

Question 23

Principe de l’électrophorèse SDS-PAGE ?

Answer 23

Plus une molécule va être massqieu plus elle sera lente dans le gel

Question 24

Utilité du SDS ?

Answer 24

Détergent => Unifie la charge des protéine proportionnellement à leur taille

Question 25

Après avoir coulé le long du gel SDS-PAGE comment sont misent en évidence les protéines ?

Answer 25

• Coloration directement sur le gel
• Utilisation d’un AC spécifique

Question 26

Principe de l’électrophorèse 2D ?

Answer 26

Séparation en fonction de l’isofocalisation et de la masse

Question 27

Principe de la chromatographie d’interactions hydrophobes ?

Answer 27

Séparation en fonction de l’hydrophobicité
=> Variation de la colonne d’hydrophile à très hydrophobe => récupération des protéine au fur et à mesure

Question 28

Activité ,

Answer 28

Quantité de protéines exprimé en terme de capacité catalytique ou biologique

Question 29

Activité spécifique ?

Answer 29

Activité par rapport à la quantité totale de l’ensemble des protéines

Question 30

Pureté ?

Answer 30

Ration entre l’activité spécifique finale et l’activité spécifique initiale

Question 31

Rendement

Answer 31

Ration entre l’activité totale finale et l’activité totale initiale