Bioch : Méthode de fractionnement Flashcards
Objectif d’un fractionnement ?
Obtenir une protéine purifiée/enrichie
Pureté de la protéine pour usage thérapeutique ?
99%
Pureté de la protéine pour cristallographie ?
95-99%
Pureté d’un antigène pour production d’AC ?
< 95%
Pourquoi faut-il limité les étape de purification ?
Pour perdre le moins possible de protéine et limiter les risques de dénaturation de celles-ci
Condition pour réaliser une lyse des protéine ?
- Tampon d’extraction à pH adapté pour la prot : pKa dans la gamme du pH
+ PARFOIS - Agents réducteurs
- Inhibiteur de protéase
- Glycérol
- Enzymes lytiques
Technique d’extraction douce ?
- Choc osmotique
- Homogénéisateur / broyeur ( Dounce ou Potter)
Techniques d’extraction brutales ?
- Presse Amico-french
- Cassage aux billes de verre
- Sonication
Avantage de la presse Amico-french ?
On peut travailler à froid => 4°C pour éviter la dénaturation des protéines
Inconvénient du cassage aux billes de verres ?
Augmentation de la T° importante
Principe de la sonication ?
- Formation de bulle par cavitation
- Croissance et explosion des bulles
- Augmentation très importante de pression et T°
- Risque de dénaturation
- Besoin de refroidir régulièrement la solution
Avantage et inconvénient de la centrifugation différentielle ?
A :
Etapes simple et rapide
I :
Apporte un faible degré de pureté
Méthode de vérification du degrés de pureté ?
- Absorption dans l’UV
- Colorimétrie
- Bradford
- Biuret
- Lowry
- Activité enzymatique
- Immuno-enzymatique (si enzyme)
Propriétés des protéine utilisée pour la purification ?
- Masse moléculaire
- Forme
- Structure
- Charge
- Densité
- Hydrophobicité/solubilité
- Etiquetage
Principe de la précipitation différentielle ?
Précipitation en fonction du pH
Techniques de séparation en fonction de la densité de la protéine ?
- Isopycnique :
- gradient de densité continu
- gradient de densité discontinu
- Zonale (gradient continu)
Principe de la focalisation isoélectrique ?
Variation du pH pour atteindre le point isoélectrique de la molécule (la où elle sera neutre)
Principe de la résine échangeuse d’ion ?
- Mélange sur la résine chargé à l’opposé de la protéine => Affinité
- Pour récupérer les protéine, prendre un ion avec une affinité + forte pour la résine que la protéine ou changement de pH
Principe de l’électrophorèse ?
Utiliser un courant électrique pour séparer les protéines avec variation de pH
Principe de l’électrophorèse de type immuno-électrophorégramme ?
Couplage de l’électrophorèse avec une solution contenant des anticorps spécifiques
Quelles sont les différentes techniques de purification qui se basent sur la taille de la protéine ?
- Filtration sur gel : tamis moléculaire
- Chromatophorèse SDS-PAGE
Qu’est ce que la zone efficace (Filtration sur gel) ?
Située entre V et Vt sur le graphique
Principe de l’électrophorèse SDS-PAGE ?
Plus une molécule va être massqieu plus elle sera lente dans le gel
Utilité du SDS ?
Détergent => Unifie la charge des protéine proportionnellement à leur taille
Après avoir coulé le long du gel SDS-PAGE comment sont misent en évidence les protéines ?
- Coloration directement sur le gel
- Utilisation d’un AC spécifique
Principe de l’électrophorèse 2D ?
Séparation en fonction de l’isofocalisation et de la masse
Principe de la chromatographie d’interactions hydrophobes ?
Séparation en fonction de l’hydrophobicité
=> Variation de la colonne d’hydrophile à très hydrophobe => récupération des protéine au fur et à mesure
Activité ,
Quantité de protéines exprimé en terme de capacité catalytique ou biologique
Activité spécifique ?
Activité par rapport à la quantité totale de l’ensemble des protéines
Pureté ?
Ration entre l’activité spécifique finale et l’activité spécifique initiale
Rendement
Ration entre l’activité totale finale et l’activité totale initiale
