Hoorcollege 19: WGS Flashcards
WES
- Onderzoek van het exoom (alle exonen van 20.000 genen), exoom is 1% van hele genoom:
- Exoom sequencing is goedkoper dan genoom sequencing
- Informatie uit exonen is belangrijk omdat intronen geen expressie hebben
Algemene info
- Bij genetisch onderzoek naar IEI > 450 genen controleren
- Genetische heterogeniteit-> 1 ziekte die door meerdere genen voorkomt
- Klinische heterogeniteit-> 1 gen kan meerdere symptomen als uiting hebben
- CID = gecombineerde immuundeficiëntie, wanneer 1 iemand in de stamboom een immuundeficiëntie heeft, dus afkomstig uit combinatie van meerdere genen
- 1 ziekte kan meerdere genen als oorzaak hebben
- 1 gen kan meerdere symptomen geven
- Als je wil testen voor IEI, dan moet je voor alle 485 genen testen
Sanger
- Baseparen een voor een bepalen om volgorde vast te stellen (base voor base)
- Tussen referentie en patiënt vergelijken
- Je zag een G en je hebt nu een A
- Solide techniek, gebruiken we nog voor als we naar 1 gen willen kijken of naar een specifieke variant die al bekend is in de familie
NGS
- Verzamelnaam verschillende technieken die je kan gebruiken om in 1x bulk aan data te testen: bulk = klein groepje van genen of veel bredere groep of hele genoom
- Veel reacties tegelijkertijd doen veel stukken tegelijkertijd bepalen
- Elke nucleotide heeft zijn eigen kleur en zo weet je de volgorde van de nucleotiden
Genetisch heterogeniteit
- Ziekte door varianten in verschillende genen
- Voorbeeld: BRCA1 en BRCA2 gen, leidt tot zelfde ziektebeeld
Klinische heterogeniteit
Symptomen kun je terugleiden naar een specifiek gen
Bron exoom/genoom onderzoek
- Bloed
- Fibroblasten (huidbiopt)
- Vruchtwater
- Speeksel
- Tumoren
Proces exoom/genoom onderzoek
Je knipt DNA is stukjes en hangt er een label aan. Je maakt het DNA enkelstreng en hybridiseert het in een base met visjes (kopiën van alle exomen die we kennen). Vervolgens laat je die visjes hybridiseren met het DNA. De visjes hebben vlaggetjes en die kunnen beads binden. Als je met een magneet de visjes eruit trekt, dan hou je alleen over wat aan de visjes gekoppeld was. De rest laat je in de oplossing zitten. Je gaat je visjes wassen en sequencen en zo worden de exomen geselecteerd
- DNA isoleren
- Exonen er uithalen
- NGS: volgorde bepalen
- De computer uit zlaten zoeken waar de reads thuishoren (bioinformatische pipeline: reads terugplaatsen op referentie (mapping))
Hoe vind je de ziekte veroorzakende variant relevant voor de patiënt?
- Filteren
- Classificeren
- Interpreteren
Targeted NGS
- Gericht naar kleine set genen kijken
- Hierdoor meer sequencen, aantal reads op plekje verhogen
- 1000 reads op plekje en je kan mozaïek detecteren
- Van tevoren zeggen welke gebieden je wilt sequencen
Analyse
File met alle gedetecteerde varianten in sample (VCF file) -> in de filter stoppen -> je houdt de input variants over.
Alle varianten die > 1% voorkomen gooien we eruit en de genen waarvan we weten dat het niks doet ook.
Vervolgens selectie maken op stukjes + 10 en – 10 na het exon. Alles wat je nu over houdt ga je classificeren
5-klassen classificatiesysteem
- Benigne variant
- Waarschijnlijk benigne variant
- Variant met onbekende klinische betekenis
- Waarschijnlijk pathogene variant
- Pathogene variant
Classificatie m.b.v. diverse databases en programma’s
- Controlepopulatie databases: GnomAD, GoNL
- Variant databases: HGMD, LOV : SIFT, polyPhen
- Eiwitpredictie programma’s: SIFT, PolyPhen
- Splicing predictie programma’s
Ben je klaar als je een diagnose hebt?
Dragerschapsonderzoek bij de ouders:
- Beide ouders drager van 1 variant compound heterozygotie
Metabool onderzoek:
- Organische zuren bepaling: mevalonzuur verhoogd in urine
- Enzymonderzoek: mevalonaarkinase activiteit in lymfocyten sterk verlaagd
Wat pil je wel op met WES?
- Single nucleotide varianten (SNV)
- Kleine deleties/duplicaties tot ca. 5 baseparen
- Grotere deleties/duplicaties (heel exon, volledig gen)
- Complexe varianten (indels)
- Varianten buiten de exonen (diep in intronen, regulerende elementen zoals promotor)
