Hoorcollege 17: Sequentieanalyse en mutatiedetectie bij primaire immuundeficiënties

Question 1

Relevantie van genetische mutatieanalyse bij PID

Answer 1

• Exacte moleculaire diagnose
• Basis voor adequate behandeling en prognose
• Vereiste voor gentherapie
• Mogelijkheid voor lange termijn preventiestrategie (ter beperking van complicaties en irreversibele orgaanschade)
• Mogelijkheden voor genetic counseling

Question 2

Verschillende technieken voor mutatieanalyse

Answer 2

• Sanger sequencen (PCR producten, fluorescent of cycle sequencen)
• NGS (WES, WGS, targeted)
• Heteroduplex analyse
• Single strand Conformation Polymorphism (SSCP) analyse
• Restrictie-enzym digestie van PCR product
• Snap shot sequencing
• Light Cycler (allel-specifieke probe, smeltcurve analyse)
• 3’ primer mismatch analyse

Question 3

Stappen sequencing

Answer 3

PCR: amplificatie of exons:
- Heat denaturation (94 graden)
- Primer annealing (60 graden)
- Primer extension (72 graden)

Sequencing of PCR products (coding exons + splice sites):
- Cycle sequencing
- DNA building blocks
- Chain termination
- Dye terminator sequencing: elke base (ddNTPs) heeft zij eigen kleur, de verschillende base zijn nu te onderscheiden door kleur
–> Automated capillary sequencing

Question 4

Typen mutaties

Answer 4

• Single nucleotide varianten
• Inserties en deleties
• Splice site varianten

Question 5

Single nucleotide varianten

Answer 5

• Silent: geen effect op aminozuur, op DNA wel, niet eiwit niveau
• Missense: verandering van aminozuur
• Nonsense: introductie stopcodon

Question 6

Inserties en deleties

Answer 6

• Verlies of verandering in eiwitdomein
• Eventueel frame shift, waardoor aminozuur verandering + vroegtijdige stopcodon: grote deleties stretches kunnen worden gemist

Question 7

Splice site varianten

Answer 7

• Up-or downstream splice site wordt gebruikt -> exon skipping, omdat de splicesite niet werkt
• Evt. Frameshift -> verandering aminozuurvolgorde en of stopcodon: splicing -> intron eruit, Donor splice site, Acceptor splice site

Als er iets gebeurd is een codon van de splice site, wordt de splice site aangetast

Question 8

Homo

Answer 8

• Beide allelen aangedaan
• Meestal met duidelijk effect op eiwitfunctie
• Bij kinderen met bloedverwantschap

Question 9

Hemi

Answer 9

• Variant op X-chromosoom
• Alleen problematisch in geval van jongen

Question 10

Hetero

Answer 10

• Slechts 1 allel aangedaan
• Meestal geen effect op eiwitfunctie, tenzij dominant negatieve variant. Als ze in een dimeer of trimeer samen moeten werken, dan kan de mutatie de werking toch beïnvloeden

Question 11

Compound heterozygoot

Answer 11

Beide allelen aangedaan, but door versch. varianten (effect vergelijkbaar met homo)

Question 12

Verschil homo en compound

Answer 12

Homo zelfde positie fout en compound op verschillende posities

Question 13

Database analysis (ziekmakend variant of polymorfisme?)

Answer 13

• ID bases: Databases voor bewezen immunodeficiëntie mutaties
• Ensembl en Gnomad genome browsers (informatie over genen, incl SNP):
• Sequence alignment van meerdere species
• Past variant bij klinische presentatie, flowcytometrische analyse of functionele assays?

Question 14

Moleculaire diagnose in nieuwe patiënt - Sanger of NGS?

Answer 14

• 3-4 kandidaatgenen bij specifiek klinisch beeld: Sanger sequencing
• > 3-4 kandidaatgenen en/of geen specifiek klinisch beeld: NGS, Targeted panel, WES met filter op PID genen
• Bevestiging gendefect vanuit array of NGS: Sanger sequencing
• Dragerschapsanalyse (vanuit variant in indexpatiënt): Sanger sequencing