Genetisk toxikologi Flashcards
Genotoxicitet
Genotoxicitet
Premutagena förändringar = Primära DNA skador: Inte mutationer, men skulle leda till mutationer Ex: DNA addukt (Reaktionsprodukt mellan DNA bas och toxikant) kan leda till mutation (Reversibla)
Genomisk instabilitet: Ex. Kromosombrott (Inte mutation men leder till mutation (Irreversibla)
Olika typer av mutationer på DNA-molekyl och/eller kromosomnivå
Mutationer på DNA-molekyl nivå: Basparsutbyte (T ersätts med G) eller läsramsförskjutningar
Mutationer på kromosomnivå kan vara:
1- Strukturella: Ex **translokation av kromosomer innebär att efter brott på två kromosomer har ett utbyte av kromosomdelar skett mellan kromosomerna. **
2- Numerisk: Felaktig antal kromosomer (23 par är normal). Trisomi 21 (47 kromosomer) = Down syndrom.
**Den normala mänskliga karyotypen är 46 kromosomer, som är organiserade i 23 par. **
Trisomi är ett specifikt exempel på en numerisk kromosomavvikelse där det finns en extra kromosom i ett par. En av de mest kända trisomierna är trisomi 21, som resulterar i att det finns** tre kromosomer i det 21:a kromosomparet**, istället för de normala två (totalt 47 kromosomer)
Varför kommer genetisk toxikologi tidigt i prekliniska studier (Akut toxicitet testas först i studierna och sedan genetisk toxikologi)?
1- **Genetisk toxikologi är en vanlig “endpoint” i sig för att, det finns ett samband mellan genetisk toxikologi och cancer. **
Mutation är inte samma sak som cancer. Det finns även samband mellan genetisk toxikologi och ärftlig sjukdom (Båda cancer och ärftlighet studier är dyra). Även samband mellan genetisk toxikologi och missbildningar som studeras.
2- **Det finns många tester (Korttidstester):
Man använder typiskt 3-4 olika tester (Snabba, enkla och billiga) **
3- Vissa genotoxiska cancerigenas anses sakna tröskeldos (Stokastiskt)
Mutation
Mutation
**Irreversibel förändring av cellens genetiska material (information) som är ärftlig på cellulär nivå. **
**Leder alltid till förändrad genotyp, men inte alltid förändrad fenotyp. **
Ärftlig på cellulär nivå: Cell med mutation och cellen delar på —> Dotter får mutationen
Mekanismer bakom mutationers uppkomst
Verkningsmekamimer som leder till gen mutation:
Mekanismer bakom mutationers uppkomst
**Verkningsmekamimer som leder till gen mutation: **
- Primära DNA-skador som inte hinner repareras på ett korrekt sätt innan cellen delar på sig (Addukten hittas inte t.ex.)
- **Felaktig DNA-replikation och/eller felaktig DNA reparation **
- Obalans i prekursor pool: (Förstadie) Om det är en obalans i mängden eller tillgången på dessa prekursorer, kan det påverka förmågan att replikera DNA och därmed celldelning och tillväxt.
- **Felaktig celldelningsprocedur **
**Tröskeldos eller inte tröskeldos: Genotoxiska ämnen kan sakna tröskelsos **
1- Mekanism: **Primära DNA-skador **
**Tänkbart utfall: leder till genmutation (GM) eller strukturell kromosom mutation (SKM) **
**Tröskeldos: Ja/nej: De har förmedlingen tröskeldos **
**Målmolekyl: DNA **
2- Mekanism: **Felaktig DNA-replikation och/eller felaktig DNA reparation **
**Tänkbart utfall: GM och SKM **
**Tröskeldos: Ja (Det räcker inte med enda mutation) **
**Målmolekyl: DNA polymeras **
3- Mekanism: **Obalans i prekursor pool **
**Tänkbart utfall: GM, SKM **
Tröskeldos: Ja (Det räcker inte med enda mutation)
**Målstruktur: Tymidinsyntas **
4- Mekanism: **Felaktig celldelningsprocedur **
**Tänkbart utfall: Numerisk kromosom mutation **
**Tröskeldos: Ja (Det räcker inte med enda mutation) **
Målstruktur: Tubulin
Tänkbara konsekvenser av mutationer
Somatiska celler och könsceller
**Tänkbara konsekvenser av mutationer **
Somatiska celler (drabbar individ): kroppsceller:
1- Celldöd: Ingen fara (Men beror på vävnad och organ). Via apoptos och vi har p53 och ATP. Tumörpresseror: Proteiner som är normalt involverade i försvar. P-53 spelar en viktig roll i att kontrollera celldelning och inducera celldöd.
p53-proteinet är en tran- skriptionsfaktor som kan stop- på cellcykeln och inducera cell- död genom apoptos som svar på vissa former av cellulär stress, t ex DNA-skada.
2- Initiering -> Celltransformation -> Cancer: cellen genomgår stegviss process
3- Missbildning
4- Missfall
5- **För tidigt åldrande **
Könsceller (drabbar avkomma & senare generationer): Bara för könsceller:
1- Missbildning
2- Missfall
3- Sterilitet
4- **Genetisk sjukdom **
Vi förutsäger att denna toxikanten når våra könsceller
**Mutation är inte en advese effect, men kan leda till (Mutation kan vara positivt för revolution) **
Vid genotoxiska studier studerar man samband mellan mutation och cancer, samt genetisk sjukdom.
Men vi har inga studier mellan exponering och ärftlig sjukdom för människor
Betydelsefulla faktorer för mutationers uppkomst och genmutations uttryck:
2 viktigaste DNA-reparationsförsvar:
Betydelsefulla faktorer för genmutations uttryck:
Allmänt om gentox tester
**Betydelsefulla faktorer för mutationers uppkomst och genmutations uttryck: **
1- Exponeringssituationen
2- Toxikokinetiken
3- Metabolisk bioaktivering/detoxifiering: balansen mellan dem. Fas I och Fas II, genotoxiska ämnen är inte moder molekylen som är toxisk utan efter Fas I och Fas II (Metaboliter)
**CYP1A1 bio aktiverar många kemiska cancer cancerigenas. **
4- **Typ av primär DNA-skada **
5- DNA-reparationsförsvar: VIKTIGT!!! Utan dem skulle vi drabbas av cancer
2 viktigaste DNA-reparationsförsvar:
1- Genom dealkylering: Reparerar primära DNA skador innan mutation (Ex: Alkyltranferaser) **(Plockar bort alkyl från DNA). Nackdelen att den kan mättas. **
2- Excision Repair: Reparerar genom “Bortklippning av skadat DNA” (ABSOLUT VIKTIGASTE REPARTIONSFÖRSVAR)
Två typer av Excision Repair: nukleotid excision och base excision (DNA polymeras är viktigaste enzym) ALLRA VIKTIGA ÄR DE TVÅ TYPER.
Betydelsefulla faktorer för genmutations uttryck:
1- Vilken typ av mutation
2- Mutationens genomslagskraft (recessiva eller dominant) Recessiv kan uttrycks om båda är recessiva.
För att en recessiv egenskap ska uttryckas i en individ, måste båda kopior av den relevanta genen vara recessiva. Om en individ bär en dominant allel och en recessiv allel för en viss egenskap, kommer den dominanta allelen att visa sitt fenotypiska uttryck.
3- Genfunktion: Om den har en viktig funktion
4- **Aktivering eller Inaktivering av gen **
5- **Cellens utvecklingsstadium **
Allmänt om gentox tester: Kan göras på levande organismer (Invivo)
Men ofta invitro studier: Cellkulturer.
**Oftast testas med och utan metaboliserande system.
Salmonella bakteriers metabolism skiljer sig från människors metabolism.
(+) (-) s9 fraktion: Ofta från leverceller. Är ett metaboliserande system, från leverceller som har hög Fas I aktivitet **
**Studien består av:
Negativ kontroll: Med vehikel
Positiv kontroll: Kvalitet granskning (Ska ge mutationer) Om inga mutationer —> Då har vi gjort fel.
En indirekt positiv kontroll: kräver metabolisk bioaktivering (S9 fraktion)
En direktverkande positiv kontroll : Kräver inte metabolisk bioaktivering (S9 fraktion) **
Alltså totalt 5 exponeringar (Positiv, negativ och 3 doser)
Primära DNA-skador = (premutagena förändringar, inaktiverande DNA-förändringar)
**Primära DNA-skador = (premutagena förändringar, inaktiverande DNA-förändringar) **
1- **Strukturella DNA-basförändringar **
Alkylering (Sker via CH3, C2H5 och ROS). Ovan är Alkylering av DNA-bas (Lågmolekylära DNA-addukt) —> FC2H5. Alkylering är en kemisk reaktion där alkylgrupper, såsom CH3 (metyl) och C2H5 (etyl), läggs till DNA-baser. **Denna reaktion kan bilda lågmolekylära DNA-addukter, där en alkylgrupp är kovalent bunden till DNA-basen. **
**Kovalent bindning av aktiva ämne och DNA —> Hög molekylära (“Bulkyl” i DNA addukten) **
Dimerbildning: Tymindimerer (UV-ljus ger upphov till detta). Tymindimerer uppstår när **två tyminförekomster i DNA-baspar bildar en kovalent bindning med varandra. **
Basbortfall: Ingen bas. Ovan (3 punkter) leder till detta till slut. (För skyddande reparation)
2- Interkalering: Genotoxiska ämnen chillar sig in (Binder inte) i bestämda positioner. Tex på ämne är hjärttoxisk och genomgår redoxcykling som Doxorubicin är cytostatikum mot bröstcancer —> Ger upphov till mutationer genom interkalering.
3- Crosslinks: är kemiska bindningar mellan två molekyler eller makromolekyler som normalt inte skulle vara bundna tillsammans. Ge upphov till alkylering
DNA-DNA crosslinks.
DNA-protein crosslinks (Uppstår på grund av formaldehyd t.ex.)
4- DNA-strängbrott: Ovan 3- (1,2 och 3) leder småningom till DNA-strängbrott
Två typer av DNA-strängbrott:
Dubbelsträngsbrott (DSB): Allvarligast
Enkelsträngsbrott (SSB)
”Standardtest” för påvisande av primära DNA-skador
”Standardtest” för påvisande av primära DNA-skador
HPC*/DNA-reparationstestet: Bygger på leverceller. För att vi får mer metabolism **(Ingen S9 fraktion behövs) **
*hepatocyte primary culture
Efter exponering tillsätts **3 H-tymidin: Prekursor till tymin (Tymin för att tymin (T) binder till DNA inte RNA) **
**Ökad inkorporering i icke-delande celler = Icke-delande celler för att vi vill mäta reparation, inte replikation **
Ökad inkorporering i icke-delande celler innebär Ökad DNA-reparation = som i sin tur innebär **Ökat antal primära DNA-skador **
Flera ljus (3 H-tymidin) som inkorperas i icke-delande celler —> Innebär ökad DNA-reparation —> **Innebär ökat antal primära DNA-skador **
Med HPC*/DNA-reparationstestet **mäter vi alltså reparations aktivitet. **
**Studien består av:
Kontroll grupp = negativ kontroll = Vehikel
Något som ger skada på arvsmassa = Positiv kontroll
Minst 3 konc. av ämnet **
HPC*/DNA-reparationstestet kan ske båda invivo eller invitro
Men nu mer används oftast Comet assay (ex på toxen)
Men nu mer används oftast Comet assay (ex på toxen)
Registrerar **DNA-strängbrott i enstaka celler **
Elektrofores under alkaliska (basisk) förhållanden: —>** Enkel- och dubbelsträngbrott (SSB & DSB) **
Elektrofores under neutrala förhållanden: —> Dubbelsträngbrott (DSB)
Kan ske invivo eller invitro
Comet assay (alkaliska förhållanden) - Steg
Comet assay (alkaliska förhållanden) - Steg
1- Odling av celler
2- Exponering av celler
3- Applicering av celler i agaros på kodade förbehandlade glas
4- Lysering av celler
5- “Uppspinning” av DNA i nukleoid
6- Elektrofores
7- Neutralisering
8- Infärgning med etidiumbromid och bildanalys
9- Avkodning och statistisk bearbetning av data
Negativ kontroll
Positiv kontroll, båda med och utan S9 fraktion
3 Konc.**
Så här ser det ut i mikroskopet
Så här ser det ut i mikroskopet
DNA är - laddad. Fosfatryggraden i DNA-molekyl är negativt laddad.
Mutationer på DNA-molekylnivå
Mutationer på DNA-molekylnivå
Punkt-, gen-, blockmutationer
Indelas efter mutationstyp:
Basparsutbyten
Förskjutningar i genetiska koden (frameshifts) (Läsrams förskjutning)
**Indelas efter vilka konsekvenser mutationerna har för proteinsyntesen: **
1- **Neutrala mutationer: Förändringar i DNA-sekvensen som inte påverkar proteinets funktion eller organismens egenskaper. **
2- **Missence mutationer: Mutation som ändrar nukleotid(er) i DNA) och leder till ändrad aminosyra i proteinet. **
3- **Nonsensmutationer: innebär att ett baspar hos DNA förändras så att istället för den aminosyra som skulle kodas, så introduceras ett stoppkodon. **
**Punkt mutation: Enstake kvävebas. Ett enda baspar har ändrat. **
**Gen mutation: Omfattar utbyten av flera DNA baser. Inkluderar utbyten av flera DNA-baser inom en gen **
**Blockmutation: Ännu större. Detta är en mer omfattande mutationstyp som påverkar längre segment av DNA. **
Gemensamt mellan dem är att de inte kan ses med ögat.
**De hittas genom 2 olika principer:
1- Förändrad fenotyp: Korttidstester bygger på denna princip
2- Med moderna molekylärbiologiska metoder **
Genotyp —> mRNA —> Aminosyra —-> “Typ”
Normal: AAA —> UUU —> Fenylanalin —> “Vildtyp” original
**Punktmutation: AAG —> UUC —> Fenylanalin (Samma fenotyp) —> Neutral mutation **
**Punktmutation: AGA —-> UCU —> serin —> Missence mutationer **
Läsrams förskjutning: ATT —-> UAA —> Stoppkod —> Nonsensmutationer
”Standardtest” för påvisande av genmutationer
”Standardtest” för påvisande av genmutationer
**Ames test: Korttidstest. Bygger på Salmonella bakterier som är modifierade. **
Indikatororganism: Salmonella typhimurium (his- ; DNA-repair - ; LPS - )
Vi börjar med mutation, och stänger av reapartion systern för att öka känslighet. Samt att LPS är lägre och svagare. Salmonella typhimurium-bakterier med specifika egenskaper, såsom his- (de kan inte producera histidin), nedsatt DNA-reparationsförmåga och svagt lipopolysackaridskikt (LPS-). **Dessa egenskaper ökar bakteriernas känslighet för mutationer. **
Indikatorgen: histidingenen
Testa med och utan S9; odla i histidinfattigt medium.
Muterade bakterier tillverkar sitt eget histidin.
Negativ, 2 st positiv (Indirekt och direkt)
Ames test kan användas för cancer gener, men inte alla cancer gener
**Negativ kontroll: Vehikel
Positiv kontroll: Substans som ger mutationer
Testsubstans: 3 olika konc. **
Bakterier saknar fungerande His + Medium + substans/vehikel (Utan S9, med S9). Vi räknar kolonier och medelvärde
Negativ kontroll: 5 + - 1
Positiv kontroll: 5737 + - 5 (P mindre än 0.0001)
Låg konc.: 4 + - 2 (P högre än 0.05)
Medel konc.: 6 + - 3 (P högre än 0.05) (NOAEL)
Hög konc.: 78 + - 2 (P mindre än 0.01) (LOAEL)
P är över 5% ej statistiskt signifikant
P mindre än 5 % statiskt säkerställd
“Standardtest” för att påvisa kromosomförändringar i enstaka celler – används även på toxen
“Standardtest” för att påvisa kromosomförändringar i enstaka celler – används även på toxen
**Mikrokärntestet (micronucleus assay) **
**Påvisar ämnen som påverkar kromosomers struktur (ex kromosombrott) = klastogener **
Aneugener: ämnen som ger upphov till felaktigt antal kromosomer
**HPC*/DNA-reparationstestet
Comet assay
Ovan detekterar primära DNA skador **
Ames test: Man studerar DNA.
**Mikrokrämtester: Klastogener och Aneugener **
Negativ, positiv och med eller utan S9 fraktion och 3 olika konc.
