celbiologie 5

Question 1

Wat is DNA sequencing?

Answer 1

Het proces waarbij de nucleïnezuursequentie van het DNA wordt vastgesteld.

DNA-sequencing omvat alle methoden en technieken die onderzoekers gebruiken om de volgorde van de vier basen te bepalen: adenine, guanine, cytosine en thymine.

Question 2

Welke verschillende manieren zijn er om de samenstelling van het DNA in beeld te brengen? (3

Answer 2

1. Sanger sequencing
2. Next-gen sequencing
3. Nanopore sequencing

Question 3

Wat heb je nodig voor Sanger sequencing?

Answer 3

1. De te onderzoeken template; een stuk DNA waarvan je de code wilt weten
2. Primers; de primers kunnen hechten aan de DNA template
3. DNA polymerase; polymerase kan vanaf de primer nieuwe nucleotiden inbouwen.
4. dNTP’s; oftewel lossen nucleotiden
5. ddNTPs; nucleotiden die in samenstelling verschillen van dNTP’s. Ze bevatten geen reactieve 3’ einde groep. Oftewel geen reactieve OH groep.

Question 4

Hoe werkt Sanger sequencing?

Answer 4

De methode is als volgt: Er wordt een mengsel gemaakt van bovenstaande benodigdheden. Allereerst zal de primer aan de DNA template hechten. Vanaf hier kan DNA polymerase nieuwe nucleotiden inbouwen. Wanneer er een ddNTPs ingebouwd wordt is er sprake van keten-terminatie. Er kunnen hierna geen nieuwe nucleotiden worden ingebouwd. Op deze manier ontstaan er verschillende ketenlengtes met aan het uiteinden verschillende ddNTPs.

De verschillende ketenlengten kunnen van elkaar gescheiden worden middels capillaire elektroforese wat een verschil aanbrengt op basis van lading. De meest korte stukken passeren eerst, daarna de langere stukken. Middels laser detectie van ddNTPs kan er achterhaald worden welke nucleotiden op welke plek zitten en hoe de DNA template er dus uitziet.

Question 5

Op welke DNA templates is Sanger sequencing toepasbaar?

Answer 5

op DNA templates van 500-1000 basenparen. Bij langere basenparen treedt er geen verschil in lengte meer op waardoor deze niet te analyseren zijn.

Question 6

Wat is een innovatie van Next generation sequencing t.o.v Sanger sequencing?

Answer 6

De reversible dye terminator. Een nucleotide met een blokkerende, fluorescerende groep die tijdelijk als terminator fungeert.

De blokkerende groep kan worden weggehaald, wat de terminator functie opheft. Er kan een nieuwe nucleotide worden aangeplakt. Op het moment dat de nucleotide die bindt aan het DNA, wordt er een fluorescent signaal herkend, wat codeert voor de juiste nucleotide.

Question 7

Wat is een verschil tussen Sanger sequencing en Next generation sequencing? (2)

Answer 7

1. de Sanger terminator fungeert altijd als terminator en de DNA sequencing stopt hier. Bij een reversibele terminator gebeurt dit niet.
2. next generation sequencing werkt met 1.000.000.000 parallelle sequencers (t.o.v 96 elektroforeses) en de te onderzoeken DNA templates zijn een stuk kleiner, zo’n 150 baseparen. Next generation sequencing werkt daarom met een factor 100.000 sneller.

Question 8

Hoe werkt Nanopore sequencing?

Answer 8

Nanopore sequencing heeft als voordeel dat het om kan gaan met extreem grote stukken DNA. Het DNA wordt niet in stukken geknipt voordat de sequencing plaatsvindt.

In het eerder getoonde spectrum met apparaten voor sequencing, bevindt Nanopore sequencing dan ook helemaal aan de rechterkant.