celbiologie 4 Flashcards
Wat is crispr-cas (natuurlijke situatie)?
het adaptief immuunsysteem van prokaryoten (bacteriën).
Wat is een bacteriofaag?
bacteriofaag (virus dat bacterie kan infecteren) infecteert bacterie cel, schiet DNA naar binnen.
Wat is een locus en waaruit bestaat dit?
Bacteriën hebben 1 groot stuk (cirkelvormig) chromosoom, hierop ligt een “locus” wat bestaat uit twee delen: het rechterdeel “crispr” en een linkerdeel bestaande uit een aantal eiwitsequenties genaamd crispr associated sequences (cas genes).
Waaruit bestaat het crispr gedeelte in een locus?
bestaat uit “repeats” en “spacers” (stukjes DNA), deze spacers kunnen veranderen door viraal DNA (wat naar binnen geschoten wordt door een bacteriofaag) in stukjes te hakken en in te bouwen als spacers. De repeats zijn repeterende sequenties DNA.
Waaruit bestaat het crispr associated sequences (cas genes) gedeelte?
Stukken DNA die coderen voor eiwitten en altijd naast de crispr locus liggen.
Wat gebeurt er wanneer een cel opnieuw met hetzelfde bacteriofaag in aanmerking komt?
cel heeft nu een beschermingsmechanisme bestaande uit twee onderdelen: enzymatisch (cas) complex + CrRNA/tracrRNA.
Wanneer viraal DNA binnenkomt bindt het cas 9 complex hieraan (complementair) en de cas eiwitten induceren hier een breuk (knipping in DNA). Dit is een hele snelle respons op her infectie.
Wat is CrRNA?
lang stuk afgeschreven streng RNA van de locus wat in stukjes wordt geknipt waarbij ieder stukje RNA bestaat uit een stukje van de spacer en een stukje van de repeat. 1 CrRNA gaat interactie aan met tracrRNA en die worden ingebouwd in de cas 9 complexen. Dit is een continue proces.
Wat is tracrRNA?
stukje stabiliteits RNA, altijd hetzelfde, nodig voor vorming volledig cas 9 complex, is complementair met stukje repeat sequentie van CrRNA.
Waarom kan cas 9 niet eigen Crispr sequentie in locus knippen vanwege complementariteit?
Er worden alleen stukjes DNA als spacer geknipt en ingebouwd waar direct erna de PAM sequentie zit. In de locus (spacers) zit deze PAM vervolgens niet. De PAM sequentie is nodig als een soort aanhechtingsplek om te knippen. Hierdoor kan cas 9 niet knippen in de locus.
Hoe kan dit natuurlijke proces van crispr-cas geïmplementeerd worden als DNA technologie?
door zelfgemaakt RNA in een cas 9 complex in te brengen kan op een hele specifieke plek DNA (complementair aan het RNA) geknipt worden.
samen met plasmide met sgRNA en de cas 9 sequentie wordt ook een plasmide als “repair template” getransfecteerd (transiënt) met de gewenste aanpassing en aan beide een deel dat homoloog is aan de target.
Cas9 knipt door het sgRNA de doelsequentie doormidden (rekening houdend met PAM sequentie 2xGG). Met behulp van de repair template wordt deze dan hersteld en de gewenste aanpassing ingebouwd.
Hoe heet dit zelfgemaakte RNA wat we in het cas 9 complex brengen?
sgRNA (single guided RNA), bestaat uit zowel repeats als tracrRNA en CrRNA. In het CrRNA hebben we meer vrijheid voor bepalen eigen sequentie.
Wat nou als je meerdere breuken wil aanbrengen?
meerdere sgRNA’s implementeren in plasmide.
