Celbiologie 2 Flashcards
Een antibiotica resistentie gen wordt vaak gebruikt om een bacterie een voordeel te geven, hoe worden deze cellen gewkeekt?
(1) maken plasmide met antibiotica resistentie gen doormiddel van knippen/plakken, (2) brengen deze plasmides in een suspensie met bacteriën waar ze doormiddel van transformatie (hitte- of elektrische shock) een plasmide opnemen. (3) door deze vervolgens te kweken in antibiotica omstandigheden treden er alleen kolonies op van de antibiotica resistente bacteriën. (4) die kolonies pak je en kweek je in grote getale. (5) uiteindelijk extractie plasmides.
Wat is Polymerase chain reaction (PCR)?
Polymerasekettingreactie, manier om uit DNA een sequentie te selecteren en daarna één of meerdere gedeeltes te multipliceren tot er genoeg van is om te analyseren / ofwel zelf kiezen welk stukje DNA je graag wil vermenigvuldigen.
Wat is er nodig voor een PCR?
- DNA template met de sequentie van interesse.
- Losse nucleotiden welke in grote hoeveelheden worden aangeboden (dNTP’s )
- Primers (kleine stukjes enkelstrengs RNA), een forward en reversed primer. Deze zijn complementair ontworpen voor de stukjes DNA sequentie.
- DNA polymerase wat strengen kan synthetiseren.
De PCR test wordt in cycli uitgevoerd, wat is de volgorde hiervan? (3)
- denaturatie
- annealing
- extensie
Wat gebeurd er tijdens denaturatie?
Reactiemengsel wordt verhit tot ca. 95 graden, hierdoor valt het DNA uit elkaar in twee enkele strengen (waterstofbruggen tussen de strengen worden verbroken).
Wat gebeurd er tijdens annealing?
De temperatuur van het mengsel wordt terug verlaagd tot 65 graden. Onder deze temperatuur hechten de primers, welke complementair zijn aan de target sequentie, aan het enkelstrengs DNA. . Het is van belang dat er dus 2 verschillende primers aanwezig zijn in het mengsel. Namelijk één passend op de ene streng en een andere passend op de andere streng.
Wat gebeurd er tijdens extensie?
De DNA polymerase (taq polymerase, hittebestendig) bindt aan de primers welke vervolgens m.b.v. losse nucleotiden complementair gaat bouwen in 5’ 3’ richting startend bij de primer. Dit gebeurt onder een temperatuur van 72 graden omdat polymerase bij deze temperatuur het meest efficiënt kan werken.
Waarom is de PCR test een exponentiële reactie?
de cycli worden telkens herhaald waarbij het eindproduct telkens uiteenvalt en de stappen herhaalt worden. Uiteindelijk zal er één PCR product gaan domineren in het mengsel, dit is het stuk wat telkens tussen/door de primers gesynthetiseerd wordt.
door dit proces n keer te doorlopen ontstaan er 2^n kopieën van het stuk DNA wat men wilt analyseren.
Hoe lang kan een door PCR gemaakt stuk DNA maximaal zijn?
Dit hangt af van verschillende voorkeuren en variabelen. Voor standaard PCR test betreft dit tussen de 200 en 1000 baseparen lang. Vanaf 2000 baseparen zal de kwaliteit van het amplicon (doelsequentie) en de PCR test sterk afnemen. Dit heeft te maken met de hoge temperatuur tijdens synthese waardoor te lange stukken DNA loslaten en interacties/bindingen met elkaar aangaan waardoor je niet meer optimaal werkt. Ook hebben we maar een beperkt aantal dNTP’s en primers in het mengsel.
Kortom fantastisch/goedkoop stuk gereedschap, maar een beperking is dat je alleen relatief korte stukken DNA kunt synthetiseren ermee.
Wat is Quantitive PCR (QPCR)?
specifieke primers ontwerpen voor de sequentie van het viraal DNA waarin je geïnteresseerd bent, wanneer je doelsequentie (virale DNA) in het mengsel zit en je de reactie laat verlopen krijg je veel DNA vermenigvuldiging, andersom bij afwezigheid niet. Hiermee kan je de dus aantonen of het aanwezig is.
Wat is complement DNA (cDNA)?
complement of copy DNA. RNA (analyseren virus) is heel instabiel en cDNA is veel stabieler, wordt verkregen via reverse transcription-PCR van mRNA. Hierbij wordt de cDNA streng gesynthetiseerd door reverse transcriptase.
op deze manier kun je bijvoorbeeld RNA virussen vermenigvuldigen of QPCR uitvoeren.
