Celbiologie 3 Flashcards
Wat is transfectie?
het proces van het overbrengen van één bepaalde nucleïne sequentie in een eukaryote cel (cel met celkern).
deze nucleïne sequentie kan sRNA/mRNA, plasmide of groot stuk RNA etc. zijn. Vanwege lading/viraliteit verpak je dit een laagje lipiden of lichtelijk positief geladen polymeer aan de buitenkant of leeg eiwit/virus capsule.
wordt door de cel via endocytose opgenomen. Binnen moet de “verpakking” verdwijnen en de sequentie moet ontsnappen aan endosomen om in het cytoplasma te komen.
Wat is het verschil tussen stabiele en transiënte transfectie?
bij stabiele transfectie wordt het vreemde gen geïntegreerd in het eigen genoom. Hier wordt het afgeschreven en gerepliceerd (doorgegeven aan dochtercellen).
bij transiënte transfectie gebeurd dit niet, maar wordt het vreemde gen wel afgeschreven.
Wat zijn de stappen die nodig zijn om d.m.v transfectie een transgene (nieuw stuk DNA tot expressie brengen) muis te krijgen?
een transgeen organisme heeft een gen van een ander organisme. hierdoor krijgt de muis andere eigenschappen.
hiervoor kweken we de embryonale stamcellen, hier brengen we het gen in doormiddel van stabiele transfectie. vervolgens cel selectie op stamcellen (kunnen onbeperkt op kweek) die het ook daadwerkelijk hebben (GFP) en deze plaats je terug in het pre-implantaat embryo. na implantatie hebben de geborenen het gen.
vervolgens in deze chimere muizen zoeken naar muizen die gemodificeerd zijn in hun geslachtscellen (hieruit vormen heterozygote en homozygote muizen)
Hoe kun je een gen op een specifieke locatie in het genoom inbouwen?
hiervoor gebruik men homologe recombinatie. Homologe recombinatie is een manier om gebroken DNA te herstellen. In dit proces kunnen nieuwe genen ingebouwd worden.
Wat is homologe recombinatie en wat heeft het te maken met reparatie van dubbelstrengsbreuken in het DNA?
Als het DNA breekt, zal het 5’ uiteinde van de strand door nuclease voor een deel worden afgebroken. Daarna bindt het 3’ uiteinde van één van de gebroken strengen aan de complementaire sequentie op de guide (ander chromosoom).
Repair polymerase bindt aan de streng en zal het missende deel van de streng aanvullen aan de hand van het DNA van de guide. De invading strand (kapotte streng) laat los en bindt weer aan de oorspronkelijke complementaire streng. Via DNA synthese wordt de guide weer gerepareerd en kan replicatie verdergaan.
Wat is het voordeel van homologe recombinatie?
DNA dubbelstrengs breuken worden opgelost zonder sequentie kwijt te raken, gegarandeerd netjes.
Hoe gebruik je homologe recombinatie om een gen op een specifieke locatie in te bouwen?
DNA wordt op een specifiek stuk gebroken (nuclease), er wordt een kunstmatige guide streng ingebracht (in de vorm van een plasmide meestal) om een mutatie of extra stuk DNA in te brengen. Deze guide streng is complementair aan de 3’ kant van de breuk van het originele stuk, het DNA gaat dan vervolgens de ingebrachte template kopiëren, waarvan je zelf dus kan bepalen wat daar instaat.
Wat is echter nog één beperking bij de kunstmatige homologe recombinatie methode?
De breuk in het DNA moet ook geforceerd worden op de precieze locatie. Dit is een technische uitdaging omdat de breuk aangebracht wordt met behulp van restrictie-enzymen. Restrictie-enzymen moeten op exact de juiste plek knippen aangezien je een matchend stukje DNA moet toevoegen.
