transgene planten: agrobacterium tumefaciens

Question 1

voordelen planten

Answer 1

• totipotent = uit 1 cel kan volledige plant genereren
• goed gekende mutanten van soorten
• zichzelf bestuiven (backcross)
• polyploïde (somaclonale variatie mogelijk in cultuur)

Question 2

methoden

Answer 2

• protoplasttransformatie/elektroporatie
• micro-injectie
• biolistics
• transfer Ti van A. tumefaciens

Question 3

somaclonale variatie

Answer 3

natuurlijke herschikking in chromosomen

Question 4

euploïdie

Answer 4

vermeerdering/vermindering volledige set chromosomen met 1 set chromosomen

Question 5

aneuploïdie

Answer 5

vermeerdering/vermindering 1 chromosoom

Question 6

protoplasttransformatie/elektroporatie

Answer 6

• celwand verwijderen > protoplast
• transformatie
  > elektroporatie protoplast > kanalen > DNA binnen
  > liposomale transfer
• selectie transformanten
• regeneratie celwand
• eventueel cel uitgroeien > plant

Question 7

micro-injectie

Answer 7

• protoplasten makkelijker in nucleus, injec in kern
• selectie regeneratie uitgroei

Question 8

biolistics

Answer 8

• protoplasten of embryonale regeneragtiestadium plantencellen
  > voordeel embr.: groeivoordeel nr regeneratie toe
• particle gun (goud/wolfraam)
• selectie regeneratie uitgroei
  x onzeker # kopijen plasmide in cel
  x transiënt: pDNA verloren tijdens opgroei

Question 9

transfer via Ti vanuit A. tumefaciens

Answer 9

= agrobacterium tumefaciens
- kroon-gal groei = fytohormonen onafhankelijke groei tumorvorming (uitschakelen bij gebruik)
- tumor inducerend (Ti) plasmide
> 200kb
> 23kb T-DNA > plant > integratie plantcel chromosoom
> T-DNA gebruiken gen X in plant Y in genoom via intermediaire vector
- hecht aan plantenwonde (katabolisatie als C-bron)

Question 10

Ti plasmide

Answer 10

• ori
• virulentieregio (overdracht T-DNA)
• conjugatieve transfer regio (overdracht Ti plasmide A.)
• T-region tss borders
  > fytohormonen: cytokinine (scheut) & auxine (wortel)
  > opinine: plant maakt opsonine voor A. (metabolisatie C-bron)

Question 11

hechting aan plant + overdracht

Answer 11

• verwonde plant > EW als wondherstel > A. herkent EW + hecht
• EW stimuleren expressie vir EW in genoom A.
• vir EW stimuleren virulentieregio Ti-plasmide > T-DNA genicked border regios
• ssDNA van Ti (virulentieproteïnen) ssT-DNA plantencel
  =» random multiple integratie = meerdere kopijen T-DNA in genoom op 1 plaatst

Question 12

techniek A. tumefaciens

Answer 12

• A. kweken in cultuur
• recombinant Ti plasmide aanmaken + in A. brengen
• T-regio met GOI in plantencel
• selectie regeneratie transgene plant

Question 13

tumorvorming vermijden

Answer 13

Ti disarmed plasmide
- deletie cytokinine, auxine & opine > GOI
> fytohormonen in medium
- Ab res, reportergenen,… bij GOI
> P nos = nopaline synthese promotor = typisch promotor constitutieve expressie in planten