probes

Question 1

homologe probes

Answer 1

= gen, = soort org.
100% match
> wanneer onvolledig deel gen gekloneerd, enkel cDNAgekent, genetische variaties (polymorfismen, mutaties)

Question 2

soorten probes

Answer 2

homologe
heterologe
back translation

Question 3

heterologe probe

Answer 3

= gen, =/= soort org
zeer verwante soorten
minder stringentie -> meer mismatch toelaten
> vals positief!!

Question 4

back translation

Answer 4

= reverse translation
alleen eiwitseq gekent
prode obv eiwitseq, rekening redunantie genetische code
> codon bias
> rond codons gelimiteerde redunantie, gebied EW AZ met beperkte # codons

Question 5

radioactieve merking + methoden

Answer 5

radioactieve isotopen (b-stralers)
> extensie willekeurige oligonucleotide primers
> nick translation
> kinatie
> opvullen 5’ uitstekende eindjes

Question 6

willekeuriige oligonucleotide

Answer 6

1 denaturatie
2 hybridisatie oligonucleotide
3 verlengd 1 radioactief NTP (a-fosfaatgroep)
!! te veel oligonucleotiden -> korte fragmenten

Question 7

nick translatie

Answer 7

1 DNase -> ss breuken -> vrije 3’OH einden
2 3’OH als substraat DNA polumerase I
3 5’3’ exonuclease activiteit -> overschrijven template
!! te veel DNase -> korte fragmenten

Question 8

kinatie

Answer 8

5’fosfaat vervangen door radioactief fosfaatgroep
1 CIP,BAP (verwijderd fosfaat)
2 T4 kinase (katalyseert gamma-fosfaat van ATP)

Question 9

opvullen 5’ uiteinden

Answer 9

sticky end als template
opgevulde door klenow met 1 radioactief gemerkt NTP

Question 10

visualisatie radioactief gemerkt

Answer 10

autoradiografie (chemiluminoscentie)
ioniserende straling -> aangeslagen -> X-stralen gevoelig -> zwartkleuring

Question 11

niet-radioactieve merking

Answer 11

directe merking
indirecte merking
digoxigenine

Question 12

directe merking

Answer 12

fluorescente merking DNA
> in situ hybridisatie
> geautomatiseerde microarray
> DNA sequentiebepaling

Question 13

indirecte merking

Answer 13

digoxigenine, biotine, covalent gebonden aan avidine
AL detectie: chemiluminogeen, fluorogeen, chromogeen

Question 14

digoxygenine

Answer 14

Dig-11-dUTP
UTP? -> enzymen die enkel UTP afbreken (clean up)
DIG-spacer-dUTP
> Al detectie: polyklonale AL tegen DIG met AP
> chemiluminoscente detectie

Question 15

biotine merking

Answer 15

biotine-16-dUTP
binding specifiek & gericht anti-biotine

Question 16

merking RNA probes

Answer 16

run-off transcriptie
SP16/T7 promoter voor te merken fragment, 1 NTP gemerkt

Question 17

hybridisatiecondities & stappen

Answer 17

prehybridisatie
voorbereiding probe en doelwit DNA
solvent & hybridisatietemperatuur
conc & duur
was & stringentie
detectie

Question 18

prehybridisatie

Answer 18

niet-specifieke bindingsplaatsen blokeren
BSA, detegrent & gedenatureerd zalmsperma DNA

Question 19

voorbereiding probe en doelwit DNA

Answer 19

SS
probe: hitte
DNA: alkalische denaturatie of hitte

Question 20

solvent & temp

Answer 20

waterig > 68°C
50 %formamide (helixDEstabiliserend) > 42°C
Tm gem DNA fragment in 1M NaCl

Question 21

conc & duur

Answer 21

sneller hoe hoger conc probe
versnellen door dextraansulfaat (10%)

Question 22

was & stringentie

Answer 22

specifiteit hangt af van stringentie
heteroduplexen
zoutconc > hogere stringentie

Question 23

toepassingen + methoden

Answer 23

• RFLP: =/= allelen van gen detecteren
  =/= allelen ander restrictie patroon
• fylogenie: verwantschappen tss organismen
  > colony/plaque lift
  > southern blot
  > nouthern blot
  > FISH (fluorescent in situ hybr)
  > LIPA (line probe assay)
  > DNA chips/ microarrays

Question 24

doel colony/plaque lift

Answer 24

specifieke genen detectie, screenen genomiche/cDNA banken

Question 25

doel southern blot

Answer 25

specifieke genen banden op gel

Question 26

doel nourthern blot

Answer 26

RNA variant, analyse genexpressie

Question 27

doel FISH + eig + tekening

Answer 27

loci specifieke genen op chromosoom detecteren, klinische toep
> DNA/RNA geïmobiliseerd
p42

Question 28

doel LIPA + tekening

Answer 28

virussen & andere pathogenen in stalen deteteren, genotypering stammen ziektekiemen & stam identificeren, opsporen specifieke allelen/mutaties
> reverse hybr
p42

Question 29

doel DNA chips en microarrays

Answer 29

expressiepatroon cellen /genetische variantie van gen tss individuen
> reverse hybr

Question 30

probleem + oplossing
EST array

Answer 30

P: afleiden hvh genen tot expressie
> enkel veronderstelling mRNA
> genen veelvoudig tot expressie oververtegenwoordigen library & microarray
O: EST (expressed sequence tag array)
cDNA kloons meerdere cDNA libraries
(=/= staalbronnen/weefsel) die deel gesequeneerd

Question 31

EST array

Answer 31

> seq ESTs geëxpreseerd & gekende seq (tag) -> systematische comp vergelijking -> identificeren
- niet alleen geexpreseerde genen
- geen bacterien (onstabiel mRNA & geen polyA)

Question 32

PCR product array

Answer 32

• computervoorspellingen
• alle ogelijke RNA oppikken
  primer -> PCR -> amplicons gespot glazen slides

Question 33

synthetische oligonucleotide array + tekening

Answer 33

• grote genomen
• in situ synthese (gene chips)
  > fotolabiele blokkerende groepen op seq, bij laser kan nt aanhechten
  > aanhechting linker aan gene chip daarop fotolabiele groepen, per ronde laser dNTP seq opgebouwd

Question 34

analyse microarrays/gene chips

Answer 34

kleur & intensiteit
specifieke statistiek om vals positieven & negatieven uitsluiten (geen systematische fouten!)
» bevestigd met RT-qPCR