expressie zoogdiercellen Flashcards
voordelen
correcte splicing & PTM
nadelen
duur
expressieniveau beperkt
moeilijk op te schalen
toepassing
onderzoek
> fysiologisch effect proteïne op celfunctie
> structuur-functie relatie EW (mutagenese)
transiënte expressievec
- vectoren episomaal
- prok seq voor rep shuttle plasmide + selectie E.coli (AB,ori)
- euk transc.- (prom,enhancer,kozak) & transl. signalen (polyA,splicejunctions)
- reportergen (fusie EW, GOI zelf)
inhoud euk expressie vec voor transiente transfectie
ori E.cloi rep
AmpR
M13 ori
CMV prom
MCS insert
(intronen)
polyA
SV40 ori Kan
neo =AB resistentiegen G418
tet on systeem + tekening
repressor + gen constitutief aangemaakt
doxycycline bind repressor -> inactief
> minder toxisch dan tetracycline
> mini CMV prom niet genoeg voor genexpressie
p58
tet off systeem + tekening
- CMV prom, tetR + DNA bindend domein, ligand bindend domein tet repressor behouden
- VP16 (activatiedom) -> act expressie
- repressor act niet behouden
- tTa (activatie dom) bind responselement (TRE)
p58
SV40 vectoren in COS/HEK293T cellen
opdrijven tot hogere expressieniveau, hoger copynumber plasmide (transiente expressie)
> meer replicatie bij t-antigen (geen T-anti geen expressie)
> meer EW
> geen gelijke verdeling dochtercellen (cellen Z p overheers)
> enkel HEK293T cellen en COS cellen
> blijft transient
stabiele integratie mogelijkheden
- homologe rec + opdrijven copy number (selectiedruk)
- retrovirale/lentivirale systemen
voor transfectie
optimaliseren conc (50% dood)
> G418 (neomycine), methotrexaat (dhfr), hygromicine B (stabiele int)
> langzaam toelaten goed expressie resistentiegen + incorporatie genoom
werking dhfr selectie
- dhfr essentiele rol aanmaak nt
> dhfr cellen (geen genoom) expressievector in cel -> GOI exp, dhfr selectie
> nucleoside vrij medium -> plasmide (aanmaak nt) overleeft
copy number dhfr
dhfr inhiberen -> dwingen # kopijen dhfr verhogen (ook GOI)
> methotrexaat omhoog > copy numbers omhoog
