expressie bacterien

Question 1

voordelen

Answer 1

gemakkelijk & goedkoop
gem. schaal vergroten
hogere expressieniveaus mogelijk

Question 2

nadelen

Answer 2

geen splicing
geen correcte PTM
niet voor proteïne secretie

Question 3

geschikte vectoren

Answer 3

kleine plasmiden met MCS, Ori, AB R,
regelbare promotor
translatie signalen
> vector: in gastheer brengen
> rec vector: menselijke manipulatie
> expressie vec: klaar om GOI tot expressie in gastheer

Question 4

translationele fusie + tekening

Answer 4

prom + translatiesignaal op vec
p52

Question 5

transcriptionele fusie + tekening

Answer 5

promotor geschikt voor gastheer op vec
TS op insert (geen frameshift)
p50

Question 6

T7 / SP6 promotoren bij lethale EW

Answer 6

eigen RNA polymerase nodig
1) afschrijven onder regelbare prom (pLac, Trp, Tac)
2) indien voldoende RNA polymerase, prom T7/SP6 actief
3) translatie & transcriptie insert
4) celdood

Question 7

tekening Plac promotor

Answer 7

p51

Question 8

werking Ptrp prom

Answer 8

conditioneel door trp in milieu
veel: prom af
weinig: ok, beetje nodig -> mRNA GOI vertaald
geen: niet aangewezen

Question 9

oplossingen high copy numebr pDNA = traag

Answer 9

1) runaway plasmide (laag copy bij lage temp
- ori repliceert obv temp
- 30°C max groei
- goed dens -> 37°C -> toename copy number
2) dubbele ori reguleerbaar actief
- ori voor low
- ori voor high

Question 10

oplossing out-of-frame fusie

Answer 10

gepaste RE site insert
> insert veranderen
> linker/adapters op insert
> PCR verlengde primers
vector veranderen
> meer RBS + AUG > =/= frames tegelijk gesynthetiseerd

Question 11

controle fusie EW

Answer 11

• sequencing
• transformatie rec expressievec > westernblot/ biologische act screenen
• restriction mapping (alleen insert opgenomen)

Question 12

tekening toep translantionele fusie

Answer 12

p53